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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
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Q. Co-IP for protein complex
Co-IP를 하고 있는데 궁금한게 있어서 이렇게 글을 올립니다. 일반적으로 Co-IP 하면 두 개의 단백질의 상호작용을 확인하는데 쓰이는 방법으로 알고 있는데, 3개의 proteins 도 가능한가요 ? 예를들어 A-flag, B-myc, C-myc. A를 flag 으로 IP 시킨 후 myc Ab's 를 사용해서 두개의 protein을 detection 할 수 있을까요 ? 이론적으로 보면 가능할 것 같은데...제가 지금 Co-IP를 이용해서 protein complex를 알아 볼려고 하거든요...많은 답변 부탁드리겠습니다.
Worrywart  |  2010.10.08
Q. Co-IP가 잘 안됩니다. ㅠㅠ
co-IP를 진행하고 있는데요. Flag으로 tagging된 단백질에 interaction partner (A)를 잡기 위한 co-IP를 진행하고 있습니다.얼마전부터 갑자기 Flag으로 IP를 하고 WB으로 A를 확인하면 전혀 signal이 보이지 않습니다.(예전에는 동일 조건으로 했을 때 signal이 선명하게 잘 보였거든요.)1. DNA construct의 문제  --> 새로 prep을 함.2. Transfection효율 --> 단백질 과발현 됨.3. IP --> 시작 lysate 양은 800~1000 ug으로 시작함. Anti-flag agarose gel을 사용.               반응시간 O/N4. Washing condition --> 0.1% TritoX-100이 포함된 TBS로 3번,                              혹은 detergent 없이 TBS로 3번5. Elution condition --> 3xFlag peptide로 elution(50 uL, 제품시트지상에는 100 uL 추천)                            또는 2x sample buffer (20 uL) 6. Antibody 상태 --> positive control로 확인 7. WB --> positive sample로 확인8. 실험실 온도 (여름) --> ice에서 진행예전에는 non-specific하게 binding한 A까지도 보여서 washing condition을 다시 잡아서 IP조건을 다 잡았다고 생각했는데,, 몇달전 부터는 IP후에 WB을 하면 Anti-flag으로 IP한 게 확인은 되는데, Co-IP가 되어야 할 A 단백질은 오고간데 없이 전혀 보이지 않는 겁니다. 어떤 부분에서 잘못된 것일까요? 고수님들의 조언을 기다립니다.   
밀크요팡  |  2010.08.27
Q. Co-IP 시 PMSF 역할
IP 실험을 하는 학생입니다.실험중 궁금한것이 생겨서 이렇게 질문드립니다.Protein A bead를 이용하여 IP 실험을 하고 있는데 IP 반응액에 PMSF를 넣어주고 안넣어주고에 따라서 최종적으로 elution 했을시밴드 패턴이 상당히 다르게 나타납니다.PMSF가 포함되어있는 경우 어느정도 specific한 결과가 나오는 반면PMSF가 포함되지 않은 상태에서 반응을 시켰을경우 non-specific한 밴드가 굉장히 많이 걸러져 나옵니다.PMSF가 protease inhibitor로서 작용하는것은 알고있는데위의 결과를 보고는 PMSF가 protease로 작용을 했다고 하기에는 결과를 설명할수 없는것 같습니다. 뭔가 다른 역할을 하고 있는것 같습니다. 어떤 역할을 하기에 이런 결과가 나왔는지 아시는분 설명 부탁드립니다.
석사  |  2010.08.26
Q. chromatin ip할 때 HA-tag antibody
mammalian cell에서 chromatin ip 할 때 잘되는HA-antibody 좋은거 아시면 알려주세요
soso  |  2010.08.16
Q. Co-IP에서 negative control 질문이요ㅠㅠ
안녕하세요.Co-IP 실험을 하고 있는데negative control에서 계속 밴드가 뜹니다.ㅠㅠ제가 보고자 하는 단백질이 20kDa정도 되는데요항상 negative control (IgG) 에서도 비슷한 사이즈에서 밴드가 나옵니다.알아보니까 light chain일 가능성이 크다고 하던데요ㅠㅠ방법이 없을까요?ㅠㅠ꼭 negative control로 IgG를 사용해야 하는지다른 경우도 있는지 알고 싶고light chain 밴드를 뜨지 않게 하는 방법을 알고싶습니다!
회원작성글 실험초보  |  2010.07.26
Q. co-ip 질문입니다~
안녕하세요얼마전에 처음으로 Co-IP실험을 진행했는데요궁금한 점이 있어서 이렇게 질문드립니다.positive control로는 RIPA buffer에 풀어진 cell lysate를 그대로 사용했고negative control로는 IgG를 사용했는데이렇게 실험을 디자인 하는게 기본인 것인지 알고 싶습니다.위에 말씀드린 대로 실험을 진행했는데생각보다 positive control이 밴드가 너무 연하게 나왔고negative control에서는 항상 20kDa 정도 되는 곳에서 밴드가 굉장히 강하게 detection됩니다.제가 실험 세팅을 잘 못하고 있는것인지...이제 막 실험을 시작한 학생이라서 모르는 부분이 많습니다.답변 부탁드릴게요^^
회원작성글 대학원생  |  2010.07.22
Q. RIP-Chip 실험 관련
RIP-Chip(RNP immunoprecipitation−microarray) 실험 관련 하여 궁금한 것이 있는데요...준비시약 중에서 Polysome lysis buffer와 NT2 buffer의 작용은 무엇인가요?
회원작성글 코코몽  |  2010.07.13
Q. his-tagged protein을 IP할 때 Ni-NTA 써도 되나요?
A라는 단백질의 C-term에 6X his tag을 붙인 vector를 cell line에 transfection 시킨 후원래는 anti-his antibody와 protein G sepharose를 써서 IP하려고 했습니다.실험실에서 보유하고 있는 anti-his antibody가 IP가 되는 것으로 알려진 것인데실제로 제 실험에서는 IP가 되지 않음을 확인하였습니다.그래서 제목에서 처럼 Ni-NTA를 써서 his-tagged protein을 IP 하고자 합니다.실험 목적은 A 단백질의 phosphorylation을 보려고 합니다.Ni-NTA 후 his-tagged antibody로 IB를 하여 internal control로 쓰고anti-phospho-A antibody로 IB하여 실험하려고 합니다.이렇게 실험하여도 문제가 없는지 궁금합니다.참고로 anti-phospho-A antibody는 굉장히 specific하여lysate에서 전혀 non-specific band가 보이지 않습니다.
쎈도리  |  2010.07.10
Q. RIPA buffer로 lysis한 후에 Co-ip해 보신 분 계신가요?
국내 업체에서 파는 10xRIPA buffer (RADIO immunoprecipitation buffer아님, 조성: 0.5M Tris(7.4), 1.5M Nacl, 2.5% deoxycholic acid, 10% NP-40, 10mM EDTA )를 사용해서 Co-IP를 setting하고 있습니다. Co-IP를 한후에 2DE를 걸어야 하는데 조건이 잘 안 잡힙니다. 제 조건은. cell lysate 5mg, purified protein : 10ug,  antibody 10ug, resin 50% slurry 80ul입니다.preclearing1시간하고 lysate는 사용했구요..purify protein과 12시간 4도씨 icubation후 antibody넣고 12시간 4도씨 바인딩 후에 resin넣고 2~3시간 binding하고 lysis buffer에 0.1% triton x-100포함된 washing buffer로 4번 washing 하고 2DE용 rehydration buffer로 elution 했습니다. 그런데 2DE(7cm)에서 spot이 나오지 않았습니다. antibody는 wb을 통해서 해당 단백질을 잘 잡는 것으로 확인되었습니다. 혹시 RIPA buffer 때문인가 해서 질문 올립니다. 그것이 아니라면 제 Co-IP에 무엇이 잘못 되었는지 실험에 tip이 있으신 고수님들께서 많은 조언 해 주셨으면 좋겠습니다. 정제된 단백질이 별로 없어서 조건을 여러개로 잡지도 못하는 상황이라서요.. 부탁드립니다.그럼 좋은 하루 되세요`
굼굼이  |  2010.04.19
Q. IP하면 계속 이상해요...;;
제가 A-Myc와 B-Flag 라는 protein이 binding을 하는지를 Test하기 위해293Tcell에 1.pCDNA3.1과 2.A와 3.B 와 4.A,B 둘다 Transfection하였습니다.그리고나서 anti Myc으로 IP를 하고anti-Flag으로 WB을 했는데A와 B가 binding 하는 것 같은데자꾸 B만 Transfection한데서도 같은 위치에서 band가 나타납니다..ㅠㅠ다시 이번에는 A-Flag과 B-Myc으로 같은 실험을 했는데요anti-Myc으로 IP anti-Flag으로 WB을 했는데이번에는 A,B둘다 Transfection한 곳과 A만 Transfection한데서band가 나왔습니다...도대체...제가 뭘잘못해서 이런걸까요...ㅠㅠPreclearing 시간도 더 늘려봤고washing도 꼬박꼬박 3번씩했는데...이유를 모르겠습니다...도와주세요...ㅠㅠ
회원작성글 신입생  |  2010.01.28
Q. Immunoprecipitation할 때, clarification의 의미가..
immunoprecipitation을 처음 해보게 된 초보 석사생입니다.ㅠImmunoprecipitation할 때, 처음 protein A sepharose를 먼저 붙이고나서 incubation을 하고,다시 centrifuge를 해서 sup을 얻고, 거기에다시 antibody를 붙이고 protein A 를 다시 붙이게 되는데요, 그 때 처음 protein A 를 붙이는 clarification을 하는 이유는 무엇인가요?
회원작성글 초보석사생.ㅠ  |  2010.01.22
Q. Yeast-two hybrid에 사용하는 vector로 mammlian cell에서 expression이 가능한가요?
안녕하세요?궁금한 것이 있어 어쭙게 되었습니다.제가 plasmid를 분양받게 되었는데목적은 Immunoprecipitation을 위해서 입니다.그런데 vector가 pGAD10 prey plasmid라서 질문드리게 되었습니다.이렇게 yeast two hybrid screening에서 사용하는 GAl4 DBD같은 것이 붙어 있는 벡터를 이용해 HeK cell 같은 세포에 over-expression 시켜 Co-IP 같은 실험이 가능한 것인가요?제가 이런 시스템에 익수기 않아 이걸 받아야 되는지 말아야 되는지 모르겠네요;;;혹시 아시는 분 있으시면 꼭 좀 알려주세요~그럼 즐거운 주말 되세요~
회원작성글 꿈꾸대  |  2010.01.16
Q. chromatin IP 실험에 대한 질문
chromatin IP 실험을 하고 있는데antibody 를 아예 넣지 않은  control sample 에서도 PCR product가 나오네요..( PCR product 자체가 nonspecific은 아닌 것 같습니다. negative primer로 PCR 하면product가 안나오는 걸로 봐서..)뭐가 문제일까요...또 Blocking agent로 Herring sperm DNA를 사용했는데 상관없나요...ChIP 해보신 분들 조언 부탁드립니다...
회원작성글 russell  |  2010.01.14
Q. promoter부위를 찾아주는 프로그램이나 웹사이트가 있으면 좀 알려주세요
안녕하세요chromatin IP 를 하려고 합니다.유전자의 promoter부위를 찾고 싶은데 어디서 찾아야 하는지 잘 모르겠네요무료로 사용할 수 있는 database가 있으면 좋겠는데 없으면 가능한 프로그램이라도..고수님들좀 알려주세요~
회원작성글 albert0127  |  2010.01.07
Q. co-IP를 하려고 합니다.
안녕하세요,이번에 새로 co-IP를 시도하게 되었는데요,293 cell에 FLAG tagging된 receptor를 (receptor A라 하겠습니다.) transfection 을 하여 발현시킨 뒤, 이 receptor A와 제가 생각하는 단백질 B가 interaction하는지를 IP를 통해 보고자 합니다.여기서 제가 궁금한 것은,기존의 IP 프로토콜들을 보면 cell lysis후, centrifuge를 하여 여기서 상층액만을 취한 뒤, 여기에 Ab를 붙이는데 receptor같은 경우는 cell membrane에 있는 것이고, 때문에 cell lysis후, 이들이 cell debris와 함께 down되어 pellet에 존재하게 된다면 본의아니게 receptor를 버리게 되는게 아닌가 싶습니다.lysis buffer에는 흔히 Triton X-100이나 NP-40이 쓰이던데 Triton X-100같은 경우 이들이 세포막을 깨는 역할을 하니 그런 걱정은 하지 않아도 되는것일까요???혹시 유사한 실험을 해보신 분이 계시면 프로토콜을 좀 부탁드려도 될까요? ㅡㅠ부탁드립니다. ( '_' ) _ _ )
연구생  |  2009.12.30
Q. protein interaction 어디까지 증명해야
protein-protein interaction보는 실험중입니다. 1. binding candidate는 Y2H에서 찾아냈고,2. 각각을 cloning후(A-Flag/ B-His) mammalian cell에 co-transfection시킨 후, His로 IP 하여 co-IP되는 것을 확인했습니다. 보통은 reciprocal IP도 해야하지만, tag위치에 따른 영향 때문인지 reciprocal IP가 안되서 그것은 포기. 3.다른 방법으로는 His pull-down 방법을 해봤는데, E.coli가 아닌 CHO cell에서 B-His를 Ni-NTA resin을 이용, purify 한 후, A를 endogenous 발현하는 mammalian cell lysate을 Ni-NTA-B His에 binding 시켜서 endogenous A의 binding을 확인할 수 있었습니다. 4. binding domain은, A 단백질을 n-term. c-term으로 나눠서 construct 제작 후, 역시 co-transfection -> co-IP로 확인.현재 여기까지 진행했는데,이로써 protein interaction한다고 하고 그 다음으로 넘어가면 되는지 아니면 또 증명해야할 것이 있는지요?그리고, 보통은 His pull-down을 E.coli에서 purify한 단백질로 진행하던데, 저는 post-translational modification까지 된 것으로 하느라 mammalian에서 진행했는데 이것도 pull-down이라 말할 수 있겠지요?
회원작성글 제삐  |  2009.12.24
Q. magnetic cell corting 할때 antibody
제가 magnetic cell corting 을 할 예정인데antibody를 어떤걸 사야하는지 모르겠어요.예를 들면,application에 flow sytometry, WB, IP 등등 있는데어떤것을 골라야 하는지 모르겠어요.MACS용 이라고 따로 쓰여져 있는걸 못봤어요ㅠ도와주세요.
김혜원  |  2009.11.24
Q. in vitro kinase assay, in vivo kinase assay
안녕하세요 ^^논문읽다가 궁금한게 생겨서요in vitro kinase assay, in vivo kinase assay 둘의 차이가 무엇인가요 ? ㅠ그리고 in vitro kinase assay 원리가 궁금합니다.보고자하는 molecule을 IP 시킨 다음..그 다음 어떤처리를 했길래 phosphorylation된 것이 보이나요? 그럼 답변 부탁드립니다아아앙 ^^
잘하고싶다  |  2009.11.18
Q. 조직으로 부터 단백질을 얻어서 IP를 할려고 하는데요....
일반적으로 IP(Immunoprecipitation) 실험들을 찾아보니 거의다 세포로 부터 단백질을 획득한 실험이 많았습니다.제가 할려고 하는 실험은 기관 및 조직으로 부터 단백질을 획득해서 IP 실험을 통해 단백질과 수용체간의 상호작용에 대해 알아볼려고 하는데요세포실험시 사용되는 lysate buffer를 똑같이 사용해되 되는지조직실험시 사용하면 좋은 buffe가 있는지에 대해 알고 싶습니다.이곳 계시판에도 몇분이 질문을 올리신것 같은데 답변은 없어서 이렇게 질문합니다고수님들의 주옥같은 조언부탁드려요~
mark1130  |  2009.10.30
Q. 인산화가 일어났는지 확신을 위한
어떠한 단백질이 인산화가 일어날것이라는 나름의 전제를 깔고 실험 중인데...태깅된 HA로 IP 한후 pTyr, pThr 등등을 붙이는데 되는것으로 관찰이 됩니다..일단 확신을 위해선 phospho specific Ab 가  non specific 하게 붙지를 않았다는것이 증명되어야할 터인데....모든 인산화를 막는 phosphatase 같은것은 있는지 혹은 어떻게 저 phospho specific Ab 붙은것이 참으로 인산화가 일어나서 그렇게되었는지... 확인할 방법이 있으시면 부탁 드립니다.
인산화 ㅋㅋ  |  2009.10.27
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