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BioLab 박소정 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문/투표/프로토콜 등록
Q. sonication 질문이요~~
단백질 추출 실험에서 세포를 파괴하기 위해서 lysis buffer를 사용했는데 그러고나서 sonication을 하는 이유는 뭔가요??? 둘 다 cell lysis를 위한 방법인데 둘 중 하나만 하면 되는거 아닌가요???
회원작성글 나의라임오렌지나무  |  2020.09.21
Q. BSA standard curve.. 질문 ..
standard 잡으려고 하는데.. 몇 번을 해봐도 값이 너무 안나오네요 ..   0~2000 그레프 이고,  25~1000 까지의 그레프 입니다.. BSA standard를 새로 만들어서 해봐도 항상 이런식의 결과가 나오네요.. BCA로 standard로 잡으면  이런식의 그레프가 나옵니다. coomassie blue로 할땐, 항상 구간이 값이 튀어버립니다. 같은 랩실의 다른분들은 coomassie blue로 해도 잘나오는데 왜 저만 coomassie blue로 하면 standard가 안잡힐까요? coomassie blue로 standard 잡으려고 족히 50번째 입니다.. sample을 새로 만들어 봐도 standard가 저런 형태로만 나오네요.. BSA standard로 쓰면 되긴 하는데, coomassie blue로만 하면 안되는지 궁금합니다. 도와주시면 감사하겠습니다 ㅠ
회원작성글 흑두루미  |  2020.09.18
Q. cytokine의 크기를 어떻게 알 수 있나요
RAW 264.7 cell에 LPS와 sample을 처리하여 cytokine이 분비되는 정도의 차이를 비교하려고 protein extraction하고 정량하고 SDS-PAGE를 하려고 합니다. 그런데 separating gel의 경우에는 분리하고자하는 단백질의 크기에 따라 gel 농도를 다르게 해주더군요. 그러면 cytokine들의 크기를 알아야 할 거 같은데 어떻게 알 수 있나요?
회원작성글 병아리연구원  |  2020.09.01
Q. Bradford assay 질문드립니다.
실험 초보입니다. 정제한 단백질(150mg)을 Bradford assay를 통해 정량하기 위해 1x PBS Buffer(2000ml)에 완전히 녹이고 assay를 실행하였으나   농도값이 0.075mg/ml를 기대했지만 0.425mg/ml가 나왔습니다. Buffer도 동시에 관측했을때 (-)값이 나오는 것으로 보아 buffer의 간섭은 없는 것으로 생각합니다. R^2값은 0.997의 수치였습니다.   단백질이 당단백질이고 자체에 당이 많이 포함되어 있을 것으로 생각되는데 이러한 점이 bradford assay에 영향을 많이 끼치나요?
회원작성글 라뇽  |  2020.08.28
Q. lysis buffer에 들어가는 Na3VO4 에 대한 질문입니다.
인녕하세요, Stock solution으로 가지고 있던 200mM Na3VO4 가 거의 다 떨어져서 새로 만들어야할 거 같은데, 구글링을 해보니 액티베이션을 시키는 프로토콜이 있고(PH10 으로 만들어서 끓임과 식힘을 반복하는 프로토콜) 그냥 물에 녹이는 프로토콜이 있더라구요. Na3VO4 가 phosphatase inhibitor 의 역할을 해준다는 것 까지는 알고 있습니다만, 현재 해당 시약을 만드셨던 선배가 없고 연구노트를 찾아봐도 잘 모르겠어서, 혹시 어떻게 쓰는 것이 맞는 방법인지 궁금합니다.  
회원작성글 힘들다힘들어  |  2020.08.25
Q. Immunoprecipitation (IP)시 antibody와 bead의 양적 관계
현재 제 실험 조건은 A라는 단백질을 당기기 위해 1) 500ug 단백질이 있는 lysate.  2) 1ug의 IP를 위한 A ab를 넣고 O/N.  3) 다음날 20ul의 bead를 넣고 2hr incubation. 4)  Wash후 elution하여 영동을 진행.  (IP는 매우 잘 되는 상황입니다)   여기서 궁금증이 생기는게 만약 동일한 1) 조건에서 B라는 단백질이  1ug 항체로는 IP가 잘 되지 않아서 3배인 3ug을 넣어서 당긴다고 했을 때 bead의 양도 (동일하게 항체가 3배가 들어 갔으니) 3배의 양인 60ul의 bead를 넣어 줘야 하는게 맞는지? 항체가 더 들어 갔어도 bead에 붙는 non-specific한 protein들 때문에 20ul로 고정을 해줘야 하는지 궁금합니다. 요약 동일 샘플에서 아래 실험 조건으로 진행을 한다면 1번 tube 500ug protein lysaste + IgG 1ug + Bead 20ul 2번 tube 500ug protein lysaste + A ab 1ug + Bead 20ul 3번 tube 500ug protein lysaste + B ab 3ug + Bead 20ul??? 60ul???
회원작성글 Ferredoxin  |  2020.08.20
Q. Bacillus 속에서 flagellin을 분리할때 dialysis membrane을 어떤것을 사용해야 하나요..?
안녕하세요 현재 미생물 flagellin관련으로 실험을 진행하고 있는 학생입니다. flagellin 분리 프로토콜에서 sodium phosphate랑 원심분리로 처리한한 미생물 배양액을 ammonium sulfate로 salting out하고 원심분리 침전물을 다시 sodium phophate에 재희석, 후 dialysis membrane으로 같은 버퍼에 투석하라고 되어 있는 과정에서  제가 dialysis membrane을 처음 써봐서 어떤 모델을 주문해야할지 고민입니다. 혹시 어떤 조건을 알아봐야하는지, 어떤 모델을 주로 사용하시는지 알려주시면 정말 감사드리겠습니다!!... 참고하고 있는 논문에서는 Sigma diagnostics에서 나온것을 사용하고 있네요..!
회원작성글 tomoguys  |  2020.08.07
Q. mitochondria fractionation 과정 중 질문입니다..
안녕하세요. 이곳에서 항상 많이 배워가는 대학원생입니다.  mitochondria fractionation을 하여 apoptosis와 관련된 단백질을 확인하는 실험을 하고자 합니다..    혹시.. 실험 전 세포를 수거하여 deep freezer에 얼려 보관해둔 세포 pellet으로 kit를 이용한 mitochondria isolation이 가능한지 여쭙고 싶습니다.  저는 상관없이 가능할 것이라고 생각했는데 안된다는 이야기도 들어서요...    그리고 하나 더 여쭙자면  protocol맨 마지막 단계에서 mitochondria pellet이 나온다고 되어 있는데 이 pellet을 2% CHAPS용액에서 단백질을 추출하라고 되어 있는데.. 혹시 2% CHAPS 용액이 아닌 다른 protein extraction solution을 써도 될까요? 예를 들면 RIPA buffer요..  항상 감사합니다. 
회원작성글 ㅁㅈㅁㅈ  |  2020.07.15
Q. N-glycan 당사슬
N-glycan 당사슬 시험에 대해 질문 여쭈어보고자 합니다. 마지막 정제 단계에서 시린지에 membrane 을 사용 하여 loading 하는데 아세토나이트릴 로 washing - sample loading- ACN96% loading 후에 물로 마지막 loading 하는이유를 잘모르겠습니다 혹시 알고 계신분 있으신가요 ????
회원작성글 Zmfh123  |  2020.07.14
Q. 암 상황에서 발현이 증가하는 단백질 검색할때
  만약 유전자X가 대장암 상황에서 발현이 증가하는 유전자 중 하나라고 가정하면 유전자X translation에 의해 합성된 단백질 X 가 대장암에서 발현이 증가하는지 여부를 확인하려면 어떤 접근방법으로 실험을 전개해야하나요??   단백질X에대한 항체는 시판되지는않는다 할때요  
회원작성글 123123  |  2020.06.15
Q. BCA assay 질문 드립니다.
안녕하세요. BCA assay 관련해서 문의를 드리려고 합니다. Thermo 사에서 판매하는 Pierce BCA protein assay kit로 primary cell의 단백질을 정량하고 있는데요. Lysis buffer는 RIPA buffer를 사용하고 있습니다. 실험 컨셉상 PBS로 cell-down 시킨 후 lysis 하지 않고, dish 위에서 바로 lysis 하고 있구요. 문제는 BCA assay standard curve를 해석하는 것 자체에서 조금 혼돈이 와서 문의를 드립니다.. 1) Sample이든 standard든 동일 부피 (10 ul)를 WR 200ul에 반응시킵니다. Standard로 매우 이쁘게 잘 그려지고요. 문제는 여기서부터입니다. BRIC의 여러 댓글들을 보니, -> sample을 10 ul 사용하였기 때문에 역추정되는 x ug 를 10으로 나눠준 것이 실제 sample의 농도임... (이해가 안가는 부분은, 역추정한 값 자체가 x ug/mL 단위의 농도가 아닌가요?... 근데 이런 댓글들이 많이 보여서 너무 혼란스럽습니다) -> 그게 아니라 말 그대로 standard 대비 역추정 한 x ug/mL이 당신이 현재 가지고 있는 sample의 농도임. (이게 제가 지금 이해하고 있었던 바인데, 샘플이 포함된 lysis buffer를 예를 들어 100 ul 가지고 있고 추정된 값이 500ug/mL라면 50ug/100uL의 단백질을 가지고 있는 것입니다) 다음과 같이 두 개의 문제에 좀 부딪혀서 고수분들에게 질문을 드리고 싶습니다. 길이 좀 길고 잘 정리하지 못해서 죄송합니다. 감사합니다.
회원작성글 Chummy  |  2020.06.01
Q. Ni-NTA 칼럼에 샘플 로딩할 때의 질문입니다.
저희 연구실에서 기존에 내려오던 방법은 lysis 후 소니케이션 해서 깨주고 lysate 를 12000rpm에서 40여분 centrifuge 후 0.45um syringe filter 로 filteration 해준 후 칼럼에 로딩을 하는 방식이었습니다. 근데 최근에 lysate 가 centrifuge 후에도 좀 끈적..? 거리는 현상이 발생하여 필터가 잘 되지 않는 현상이 자주 발생하고 있습니다. 혹시 이러는 이유를 알 수 있을까요? 이를 해결하기 위해서는 무엇을 해야하나요? 그리고 꼭 0.45um 필터는 필수적인가요?
회원작성글 클레엉  |  2020.05.16
Q. HPLC 전처리 과정중 모르는게 있습니다 ㅜ
균질화한 검체(근육, 간, 신장, 지방, 알, 어류) 1.0 g을 정밀히 달아 15 mL 원심분리관에 넣은 후 아세토니트릴 5 mL를 첨가하고 약 1분간 균질화하고 10분간 초음파 처리한다. 이를 다시 10분간 원심분리(4,500 G)한 후, 위의 과정을 2회 반복하여 상층액을 합하여 C18 충전제 100 mg을 첨가해 둔 원심분리관에 넣는다. 이 용액을 약 30초간 강하게 균질화하여 C18 충전제를 분산시키고 이를 다시 10분간 원심분리(4,500 G)한 후 시험관에 상층액만 취하여 질소를 이용하여 농축시킨다. 남은 잔류물에 이동상 1 mL를 가한 뒤 약 5분간 초음파 처리하여 용해시킨 후 막 여과지(membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다. 여기서 C18 충전제 100 mg이 무엇인지 잘모르겠어요.. 파는 곳이나 사진좀 알려주시면 감사하겠습니다 ㅜㅜ
회원작성글 HCL  |  2020.05.12
Q. western sample 용 세포를 하베스트시, 어떤 스텝에서 -20도 보관이 가능한가요?
western sample 용 세포를 하베스트시, 어떤 스텝에서 -20도 보관이 가능한가요? 그동안은 SDS PAGE sample buffer 에 넣어서 얼려뒀었습니다만, 제가 내일은 그 상태까지 만들어두지 못하고 얼려둬야할거같은데요,  1. PBS 워시 하고 바로 얼린다 2. Lysis buffer 넣고 scrapping 없이 얼린다. 혹은 그 외에 어떤 스텝에서 얼려야할까요?ㅠㅠ
회원작성글 클레엉  |  2020.05.08
Q. 선생님들ㅜㅜ대장균의 호흡산물들 종류별로 분류하는 방법에는 무엇이 있을까요?
대장균의 호흡산물들을 각기 분류해내려고 하는데요, 어떤 방법들이 있나요? 마치 캘빈회로 발견할 때 크로마토그래피를 이용하여 RuBP,G3P등을 분리해낸 것처럼요 그리고 대장균에서 대장균의 호흡산물만 어떻게 분리해낼 수 있나요?
회원작성글 물음표쟁이  |  2020.05.05
Q. 단백질 정량 protocol 질문입니다.
His 단백질 정량을 하고 있습니다. Protocol에서 1.Add two resin-bed volumes of Equilibration Buffer and mix until the resin is fully suspended. 2.Prepare sample by mixing the protein extract with an equal volume of Equilibration Buffer. The total volume should equal at least two volumes of the resin bed. 위에 2 과정이 있는데 resin은 Equilibration buffer을 써서 평형상태를 만들어 준다는 건 이해가되는데 2번째 프로토콜에서 단백질도 평형상태로 만드는데 단백질도 평형상태로 왜 만들어야하는지 이해가 안됩니다. 또, 만약 10ml의 단백질 추출물이 있다면, 2번째 프로토콜대로 하면 10ml의 Equilibration buffer을 넣어 총 20ml이 되는데 그럼 이때는 resin을 최소 10ml써야하는 건가요?? resin의 양이 너무 많다고 느껴지는데.. 조언부탁드립니다. 마지막으로, Samples containing 6M guanidine•HCl must be dialyzed against a buffer containing 8M urea before SDS-PAGE analysis.라는 부분이 있는데 guandine을 없애기 위해서 8M의 Urea가 포함된 1xPBS에서 dialysis을 시키라고 되어있는데 1L의 PBS당 얼마정도의 8M의 urea를 넣어서 dialysis시켜야하나요?? 조언의 답변 부탁드리겠습니다.
회원작성글 202020  |  2020.04.30
Q. 원심분리기를 이용한 세포소기관 분리 방법 질문
제가 단백질 활성도 실험을 하기 위해서 원심분리기를 이용해 세포소기관을 분리하려고 합니다.  핵과 골지체가  필요한데, 미토콘드리아를 포함하지 않게 잘 분리할 수 있는 방법이 있을까요?
회원작성글 zionlee  |  2020.04.30
Q. sonication
안경세척용 초음파세척기로도 단백질 깨질까요?
회원작성글 라꼼  |  2020.04.17
Q. 단백질 정량 관련 - total, soluble, insoluble
안녕하세요. 환경공학 석사 2학기 과정 대학원생입니다. 생물 실험 관련하여 여쭤볼게 있어 질문 올립니다. 미세조류내 total protein의 양을 정량하고자 실험을 진행하고 있습니다. 정량 프로토콜은 1. sample의 원심분리를 통한 pellet 생성 (PBS washing 3번) 2. pellet을 RIPA buffer로 resuspension 3. microtube 2ml 넣고 sonication bath에서 10분간 sonication 4. 원심분리 후 상층액을 따서 BCA 정량키트로 단백량 확인. 입니다. 여쭤보고싶은것은 1. 전반적으로 실험과정에서 문제가 있을지.  2. 4번에서 상층액의 단백질은 soluble단백질이라 하였는데, 그렇다면 total 단백질의 양을 알기 위해서 pellet의 insoluble 단백질양은 어떻게 확인 할 수 있을지 여쭤뵙니다. (RIPA Buffer에 SDS 1%를 추가로 넣으면 단백질에 음전하를 띄게하여 insoluble도 같이 상층액에 녹는다는 말을 들었는데, 정확한 레퍼런스가 없습니다.) 추가실험으로 western blot 등은 하지 않을 것이고 total protein의 양만 알면될거 같습니다.  생명공학이 주전공이 아니라서 짧은 지식 양해부탁드립니다. 선배님들의 조언 부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 불가리스  |  2020.04.14
Q. protein 분리방법,,,,
안녕하세요... protein 두가지를 cleavage site로 연결 시켜 놓은 것을 enzyme로 digestion하여 두가지 protein을 분리 시키려고 합니다. 1번째 protein은 16kDa이고 2번째 protein은 7kDa이라서 10k filter를 이용하여 protein을 분리하려고 하였으나 weston결과를 보니 전혀 분리 되지 않았습니다. 상층액에 있던 solution을 회수하여 weston 같이 했는데 거기에 7kDa인 protein도 있더라구요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 10k filter다음에는 30k라 선뜻 하지 못하고 있습니다. ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 고수님들 조언부탁드립니다.   어떻게 해야 yield 좋게 분리 할 수 있을까요??ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 초보석사쌤  |  2020.04.09
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