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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. 반복되는 sequence의 cloning 노하우 있으신가요 ??
안녕하세요,   저는 최근에 Parvovirus를 활용해서 gene transfer 하는 방법에 대해서 공부하고 있습니다.   그런데, 저희 연구실 선배님들도 예전에 pravovirus의 full sequence를 cloning을 시도해보셨다고 하더라고요. 그런데 여기서 parvovirus의 양끝의 haripin 구조 때문에 이부분의 PCR과 cloning과정에서 많은 문제를 겪고 결국 성공하지 못했다고 들었습니다.  그래서 몇가지 reference를 찾아봤는데 다들 그냥 cloning했다고만 되어있더라고요... 혹시 요런 부분을 쉽게 cloning할 수 있는 knowhow라거나 다른 방법들이 있을까요 ??    긴글 읽어주셔서 감사합니다~ 
회원작성글 Anchovy  |  03.08
Q. titer단위인 Vg/ml을 질량단위인 mg으로 변환가능한가요?
제가 사용하려는 AAV-vector가 있는데 설명을 보면 질량 표기가아닌 viral genome/ml로 표기가 되어 있습니다. 실험에 사용하려면 질량단위가 필요한데 단위변환이 가능한가요?
회원작성글 냠냠긋  |  03.07
Q. site directed mutagenesis(SDM) 할 때 디자인한 primer에 phosphate 있어야 하나요?
안녕하세요. SDM 처음하는 대학원생입니다. 프라이머 디자인 중인데, 프라이머 5 프라임 끝에  phosphate가 있어야 나중에 pcr 하고 dpn 처리하고 transformation 과정에서 잘 붙을 수 있을 것 같은데 프라이머 디자인 시 phosphate를 붙여서 디자인 해야하나요??
회원작성글 bioer  |  03.05
Q. 클로닝 질문 드립니다.
현재 실험실에서 gene cloning을 진행하고 있습니다. cloning을 진행하고 마지막에 논문 데이터를 위해 double band가 나오지 않아 애를 먹고 있습니다. 현재 pET-15b 벡터를 사용중이고 제가 삽입하고자 하는 dna는 210bp정도로 아주 짧습니다. 나중에 정제에 용이하기 위해서 프라이머에 임의로 IEGR을 달아서 factor Xa서열을 달아주라고 하시더라구요 (학부생이라서 자세히 모릅니다 ㅠㅠ..) 근데 계속 클로닝이 되지 않아서 vector를 pCold1으로 바꾸려고 하는데요, pCold1에는 이미 factor Xa이 존재한다고 하더라구요 이 경우에 프라이머를 다시 디자인해서 IEGR없이 디자인하고 pCold1으로 클로닝을 진행하면 나중에 정제할 때 문제가 안생기는게 맞나요?  근데 이 pCold1이 CspA promoter를 이용한다고 하는데 제가 클로닝하려는 단백질이 Csp와 관련된 family protein입니다. 이 때 다른 문제가 발생할까요? ㅠㅠㅠ클로닝 세달째 하고 있어서 이제 너무 지쳐요ㅜㅜㅜ
회원작성글 맹구맹맹  |  03.03
Q. plasmid DNA 전기영동 결과 해석해주세요 ㅜ
제한효소를 처리하지 않은 Plasmid 를 전기영동 내린 결과입니다. plasmid의 크기는 5.3kb 정도이며, 겔은 1%로 50V 190min 진행하였습니다. marker는 100plus DNA ladder(바이오니아) 제품입니다. 실험결과 사진입니다. lladder와 비교하면 10,200bp 이상의 위치에서 band가 관찰되었는데, 왜 그런지 이유를 못 찾겠습니다 ㅜ DNA농도가 높아 band가 끌리지 않나 싶어 희석을 해서 실험을 해보았는데, 그것도 위와 같은 결과로 band의 위치가 5300bp 근처에서 나타나지 않았습니다ㅜㅜ 왜그럴까요ㅜㅜ
회원작성글 으아앙ㄱ  |  02.28
Q. linker 삽입 Vector pcr
안녕하세요 N term his tag - Gene 형태의 plasmid에서 tag과 gene 사이에 GS linker (G10S1)을 넣어주려고 하는데요, overhang 으로 linker를 달아 primer를 주문하려고 합니다!             FWD) G10S1-Gene (일부)  (plasmid) Histag-------Gene 1) Vector- Histag)REV 2) Vector- histag-G10S1)REV   [질문] 1. 그렇다면 이때 REV primer는 1번과 2번 중 무엇을 사용해야하나요..?  1번 REV primer는 이미 있는 primer로 아마 전에 이 plasmid cloning을 위해 사용한 primer 같습니다. 2번같은 경우 dimer가 걱정되기는 하는데 교수님께서 hot start로 하면 dimer 문제는 신경쓸 필요가 없다고 하셔서요..   2. 그리고 위 처럼 linker pcr을 했을 경우 product가 원형인가요..? 선형이라면 ligation 작업이 필요한건가요?    3. 아니면 1번으로도 작업하고, 2번으로도 작업해서 Dpn 1처리후 Gibson assembly로 ligation 해도 될까요?     답변 부탁드립니다 감사합니다 ㅠㅠ
회원작성글 냥뮹  |  02.28
Q. E.coli transformation 이후에 항생제 안들어간 LB broth에서 배양하는 이유가 궁금합니다
mini prep 과정에서 재조합 플라스미드를 E.coli에 transformation 한 이후 항생제가 들어가지 않은 LB broth에 넣고 1시간 배양한 후 항생제가 들어간 LB 배지에 spreading을 하는데 왜 처음부터 항생제 들어간 LB broth 에서 키우지 않는 이유가 뭔가요? 형질 전환이 됐으면 처음부터 항생제가 들어간 LB broth를 사용해도 되지 않나요?
회원작성글 애월  |  02.23
Q. VectorBuilder에서 gene cloning 서비스를 이용하려고 합니다
  안녕하세요. KDM1A라는 유전자를 cell line에서 overexpression시키려고하는데 cloning에 자신이 없어 vectorbuilder라는 업체에 클로닝을 의뢰하려 합니다.  현재 저희 랩실에서 overexpression을 시키기 위해 사용하는 방법은 lentivirus를 이용하는 것이며, vsvg, plp1/2와 같이 transfection시킨  293T cell을 이용하고 있습니다. 해당 벡터로 클로닝을 맡겨도 되는 것인지 궁금하며 여러 고수분들의 의견을 듣고 싶습니다.  감사합니다.
회원작성글 Minuate  |  02.22
Q. Cloning 관련
cloning을 진행하고 있는 석사연구생입니다. TA cloning까지는 시퀀싱 결과, 다 제대로 되었는데요, 이후 과정에서 문제가 생겼습니다. Enzyme cut - pcrk purification - Enzyme cut - gel extraction - ligation을 하였는데, 자꾸만 마지막 시퀀싱을 진행해보면 결과가 나오지 않습니다.   1) kit 상에는 ligation의 비율을 1:3으로 하라고 되어있는데, 혹시나 해서 3:1, 1:6까지 비율을 다양하게 진행해 보았습니다. 그럼에도 불구하고 클로닝이 되지 않습니다. 2) enzyme cut이 프로토콜 상에는 37도 한시간 이지만, 컷팅을 더 길게해서 확실하게 잘라보기도 하였습니다. 3) 시퀀셜하게 enzyme cut도 해 보았고, 2개의 enzyme을 동시에 처리하여 cut하는 방법도 시도해 보았습니다.   위의 방법을 모두 시도하였는데도 불구하고, 클로닝이 되지 않았습니다. 혹시 어떤 방법을 더 시도해보면 좋을까요?
회원작성글 jjnli  |  02.19
Q. PCR product를 시퀀싱 보내는 경우는 어떻게하나요??
안녕하세요 선생님들 하나 궁금한게 생겨서 질문드립니다 클로닝 진행중에 시퀀싱을 보내면 자꾸 한 두 서열이 mismatch가 일어나서요 찾아보니 pcr product 자체를 시퀀싱하는 경우도있더라구요 그래서 지금 진행중인 것과 template가되는 원본(plasmid)이랑 한번 비교를 해보고 싶어서요 단순 pcr 에러로 발생한건지 혹은 사용한 template 자체에서 바뀐것인지 확인하려고합니다 여기서 궁금한게 보통 M13F나 M13R같이 일반적인 시퀀싱용 프라이머로 읽고 예외적인 애들은 시퀀싱용 프라이머를 따로 디자인해서 읽었거든요 제가 처음에 배울때부터 시퀀싱이 시작되는 대략적으로 100bp까지는 크로마토그래피로 확인할수있듯이 피크가 지저분해서 여유있게 시퀀싱을 진행하라고 배웠고 실제 몇번은 시작하는쪽에서 지저분했던것을 확인했었습니다 그럼 여기서 pcr product를 읽기위해 pcr product의 시작과 끝쪽에 시퀀싱용 프라이머를 디자인한다면 온전한 pcr product의 시퀀스를 확보할 수 없는게 아닌가해서 진행을 못하고있습니다 지금과같은 실험을 진행해보신 선생님들의 조언이 듣고싶습니다
회원작성글 soonlok  |  02.15
Q. his tag, t7 tag
안녕하세요. 실험실 2개월차 학생입니다. 표적유전자를 expression vector에 넣으려고 합니다. vector는 pET 28a-c(+)를 사용합니다. PCR까지는 잘되서 sequencing으로 서열은 확보해둔 상태이고 vector의 restriction enzyme에 맞춰서 primer짜려고 하는데 his tag, t7 tag는 사용하려는 restriction enzyme에 따라서 결정하면 되나요?? 찾아보면 같은 역할을 하는것 같은데 어떤 점에서 차이가 있는지 잘 모르겠습니다. vector 만든 회사인 Novagen에서 올려둔 protocol을 읽어보고 있는데 tag에 대한 설명은 잘 안나와있네요..
회원작성글 _유월  |  02.11
Q. transformation 시 LB를 안정화 이전에 먼저 넣어버렸습니다.
안녕하세요 연구실에서 cloning을 배우고 있는 학부생입니다. transformation 시 heat shock을 준 후 ice에 5분 박아둔 후 LB를 넣고 incubation하여 recovery시켜주어야 했는데, 실수로 42도 heat shock 1m30s 이후에 아이스에 박자마자 바로 LB를 넣어버렸네요   이 경우 transformation 효율이 떨어지거나 잘 되지 않을 수 있나요?   (ice에서 5분 방치해둔 후에는 37도에서 incubation 30분 정도는 그대로 진행했습니다.)   +competent cell은 K12였습니다!
회원작성글 뭉치치  |  02.10
Q. lentiviral vector에 원하는 유전자를 끼워넣는 방법
3세대 lentiviral vector를 이용하여 reporter gene assay를 셋팅하려고 합니다. 구입이 결정된 vector의 protocol를 읽고 있는데, 어떻게 vector에 원하는 유전자를 삽입하는 건지 잘 모르겠습니다. 유전자 클로닝 해본 고수님 있으시면 의견 부탁드립니다.
회원작성글 juyu21  |  02.02
Q. Mammalian cell transfection용 fluorescence labeled-cloning vector 추천부탁드립니다.
안녕하세요. 특정 gene 삽입해서 recombinant plasmid 만들고 transformation으로 cloning 후에 mammalian cell line에 transfection하려고 합니다. mCherry나 GFP등 fluorescence가 tag되어 있는 cloning vector 추천 부탁드려요. 혹시 TA-cloning kit이나 blunt-end cloning kit이 있다면 같이 추천해주시면 더 좋을 것 같습니다.   답변 미리 감사드립니다!
회원작성글 지겹당  |  02.01
Q. Ligation 시 sticky end 부분이 비슷해도 ligation이 될 확률이 있나요 ?
양쪽 제한효소 서열이 MluI과 AclI입니다. 두 가지 제한효소가 만드는 sticky end 서열이 각각 5'-CGCG-3' 5'-CG-3' 입니다.   ligation하는데 일단 CG 서열이 서로 상보적으로 수소결합을 할거같은데 한쪽 가닥이라도 ligation이 될수가 있는건가요? 아니면 self ligation이 안된다고 그냥 무시하고 가도되는건가요 ?
회원작성글 마이어  |  01.31
Q. dnasu homepage
안녕하세요    cDNA library를 구매하고자 하는데 dnasu 라는 미국 업체 홈페이지가   연구실에서는 접속이 되는데 집, 기타 다른 업체들에서는 접속이 안된다고 연락을 받았습니다...   원인이 뭘까요... 집에서도 검색하고 싶은데 도통 접속이 안됩니다...   dnasu.org  입니다.    google에 dnasu로 검색해도 첫번째에 바로 뜨는 유명한 dna plasmid deposit company인데 왜 접속이 안되는걸까요....    
회원작성글 NCCKJH  |  01.30
Q. cloning 질문
안녕하세요 이번에 새로 석사를 진행하는 학생입니다 1) 혹시 cloning진행시 insert gene을 얻기 위해 pcr을 진행하려고 하는데 primer디자인 할 때, insert seq만 넣었을때 18mer 로 잡으면 60도가 넘어가게 됩니다.. 온도와 길이중 어느것을 더 중점으로 잡고 진행해야할까요??ㅠㅠㅠ 2) 위에 이어서 질문이지만 primer에 제한효소 구역을 넣어줬는데요 이 구간의 일부분이 template에 붙는다고 나옵니다. 이때 제한효소가 붙었을 때 온도를 고려해야 하나요?? 제 생각에는 고려해서 붙은 tm값으로 진행 해야한다고 생각하는데 혹시나 해서 질문 올립니다. 정말 기본적인 질문일수 있습니다… 어제 하루종일 고민해도 답이 안나오는거 같아서 질문 올립니다. 답변해주시는 모든분들 항상 실험성공의 길만 걷길 기원하겟습니다!!
회원작성글 으아아아아아아아  |  01.28
Q. transfection, luciferase assay 실험 방법
벡터 구입 후 trasfection하여 lucifesae assay 실험 예정 입니다. 처음 해보는 실험이라 방법을 셋팅해야 됩니다ㅜㅜ 혹시 이 실험의 전체적인 실험방법 (굵직하게)알 수 있을까요?    
회원작성글 juyu21  |  01.27
Q. restriction enzyme 처리 시 dna 가 완전히 cut 되지 않는 현상
cloning 을 위해 restriction enzyme digestion 을 진행하고 있습니다. one cut 후 agarose gel 로 dna 가 완전히 잘렸는지 확인한 다음 두번째 enzyme 을 처리하려고 하는데, 충분한 양의 enzyme 을 넣어주고 over night incubation 했음에도 불구하고 vector 가 완전히 절단되지 않아 linear band 포함 two band 가 뜹니다... 처음엔 NEB 의 restriction enzyme protocol 대로 진행하다 enzyme 양을 늘리고 incubation time 도 늘리게 된 것인데 바뀌는 것이 없네요. 조언 부탁드립니다.
회원작성글 움가  |  01.25
Q. Cloning 시 MCS에 제한효소 두개가 너무 인접하면 안되나요?
XbaI _ EcoRI 사이에 6bp밖에 차이가 안나는데 예~전에 선배님한테 클로닝 배울적에 너무 가까이 있으면 잘 안짤린다..라고 배웠어가지고.. 클로닝 하는데 너무 제대로 안들어가서 다시 확인해보니까 두 제한효소가 너무 가깝게 붙어있더라구요. 해당 Vector내에 MCS에 XbaI,NheI,EcoRI,SwaI,BamHI,NotI이 있습니다만 NheI과 BamHI은 제가 집어넣으려는 gene 내부에도 존재해서 사용할 수가 업소, gene 뒤에 달린 myc-ddk tag까지 다 통쨰로 집어넣으려고 하는데 data sheet보니까 gene이랑 tag 사이에 NotI이 또 있어서 NotI도 쓸 수가 없습니다 ㅋㅋㅋㅋ;;;  실험실에 SwaI이 없어서...이 제한효소는 구매하면 뭐 딱히 상관없는데.. 결국 그래서 XbaI이랑 EcoRI으로 PCR돌려서 product 만든 후에, 집어넣다가 혹시나 궁금해서 여쭤봅니다. 일단 현재는 너무 안잘리는것 같아서 하나씩 이틀에 걸쳐서 첫날엔 XbaI으로만 잘라서 purification 후, 다시 EcoRI으로 잘라서 지금 ligation 시도해보고 있습니다..      
회원작성글 토라  |  01.24
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