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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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Q. transfer 후에 marker는 사라지고 portein은 확인되는 현상 첨부파일
안녕하세요, 대학원 석사 과정 중에 있는 학생입니다. 제목에서처럼 western blot 진행 과정에서 transfer 전에는 marker가 잘 확인 되었고, transfer 후에 gel에는 없지만 membrane에서 marker가 확인되지 않아(정확히는 매우 연하게, 없다싶을 정도로), transfer가 잘 되지 않았다고 판단했습니다. 그래도 혹시 몰라 antibody를 붙여 확인해보았는데, beta-actin 기준 protein 밴드가 뚜렷하게 나타나서... 혹시 transfer 후에 marker는 사라졌으나 protein은 잘 옮겨가는 경우도 있나요? 제가 그 membrane과 똑같은 조건으로 다른 membrane도 동시에 실험 진행 중이었는데, 다른 membrane은 marker가 잘 확인 되었고, protein도 잘 나타났습니다. transfer buffer는 똑같은 것을 사용했기 때문에 문제가 없다고 생각하고, 한 기기에서 두 개의 transfer tank를 연결했기 때문에 기기의 문제라고 보기도 어렵다고 생각합니다. 전압은 100V, 100분으로 설정하였고, gel 농도는 10%입니다. 사진은 beta-actin이고, marker가 확인 된 것과 안 된 것 입니다.(동시에 진행된 membrane입니다.) 혹시 비슷한 경험과 원인, 조언 주시면 감사하겠습니다ㅜㅜ
회원작성글 shinhwa  |  09.20
Q. DNA 추출 시 NaOH의 역할
혈액의 genomic DNA 추출 과정에서 protocol 중 0.1N NaOH를 첨가 후 3분간 65도에서 반응시키는 단계가 있는데   이때 0.1N NaOH의 역할이 뭔가요??   NaOH는 plasmis DNA 분리할 떄 dsDNA를 ssDNA로 분해시킨다고 알고 있는데.. Genomic DNA 추출시에도 사용하는건가요?   그리고 혈액에 NaOH를 넣고 잠시 반응시키면 검은색으로 변하는데 그 이유가 무엇인가요?  
회원작성글 KXXXDO  |  09.20
Q. Promoter를 만들려고 하는데 앞 뒤 sequence를 알 수가 없습니다.
안녕하세요 대학원 초년생입니다. 랩 구성원의 도움을 받기 힘들어서 질문글을 올리게 되었습니다.   Pichia ciferrii의 Translation elongation factor(TEF) promoter를 chormosomal DNA에서 PCR로 떠서 만들려고 합니다.   NCBI에서 TEF의 protein은 찾았는데, TEF gene에 대해서는 찾지 못해서 일단 protein sequence를 확인해왔습니다. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF552563.1?from=1&to=867 해당 sequence의 앞쪽 seq을 알아야 promoter primer를 디자인 할 수 있을 것 같은데, 확인할 수 있는 방법이 있을까요?   추가적으로 하나만 더 질문 드리자면, Translation elongation factor와 elongation factor는 동일한 것인지 여쭙고 싶습니다.. Translation elongation factor and pichia ciferrii 로 검색을 했을 때 EF는 많이 나오는데 TEF는 검색되지 않아서요..  
회원작성글 수박고구마  |  09.20
Q. ELISA 진행할 때 같은 샘플에서도 다른 결과가 나오네요;;
안녕하세요.  저는 최근에 Extracellular vesicle 연구를 시작한 대학원생입니다.  EV의 isolation이후 ELISA로 CD63 단백질 발현을 확인하며 EV의 양을 가늠해 보고 있는데요.  문제는 ELISA 결과를 보면 같은 샘플에 대해서도 어떤 well은 반응이 뜨고 어떤 well은 뜨지 않으면서 편차가 굉장히 크다는 것입니다.  물론 손으로 실험 하다보면 당연히 편차는 생기는 것이겠지만 그 정도가 OD 기준으로 10배 가까이 발생하기도 합니다.  혹시 이런 경우 실험의 숙련도와 상관 없이 고려해봐야 하는 이슈가 뭐가 있는지 경험 많으신 분들께 여쭙니다.  감사합니다. 
회원작성글 대학원생327  |  09.20
Q. HisPur Ni-NTA Purification시 Protein aggregation
안녕하세요, 저는 현재 A라는 eukaryotic protein을 E.coli에서 발현 중에 있습니다. A라는 protein을 insoluble하게 발현하여 activity가 있는 것을 확인했으며, A라는 Eukaryotic protein을 B라는 protein과 한 T7 promoter상에서 연결하여 발현 중에 있는데, 제가 원하는 site에서 보이지 않아 질문을 남겨봅니다. Vector는 pET28a(+)를 사용하여 N,C-ter 양쪽 모두 His-tag이 붙어있습니다. Induction condition은 16~37도 까지 Time 역시 바꿔가면서 Optimization을 모두 진행해보았는데 되질 않는 것 같습니다.  제가 Target으로 하는 예상 kDa는 62kDa인데, Induction후에 whole protein, pellet에는 예상 kDa부근에서 보이는데 Elution시에는 보이지 않고 30kDa부근에서 보입니다. Elution은 imidazole 250mM~300mM로 진행하였습니다. 따라서 protein이 insoluble하거나 His-tag 정제 시 문제가 있는 것 같아 보이는데, 해결이 되질 않습니다. 제가 놓친 부분이 있을까요? 참고로 loading 시 boiling도 하였고, 중간에 종결코돈도 없습니다. 아래 사진 첨부드립니다. 감사합니다.
회원작성글 agaz  |  09.20
Q. 661W 또는 RGC5 세포 분양
안녕하세요. 눈 관련 연구를 진행하고 있는 대학원생입니다. in vitro 실험을 위해 cell line이 필요한데, ATCC에서 판매하고 있지 않아서요.   661W 또는 RGC5 cell line을 분양받고 싶은데 실험실에 이 cell line이 있으신 분이 계실까요?
회원작성글 오예12345  |  09.20
Q. 아가로스겔 반점??
연구실에서 근무한지 얼마 안된 2학년 학부생입니다 전기영동 결과 아가로스겔이 저렇게 나왔는데 이건 무슨 문제일까요?ㅠㅠ 겔만들때 불순물이 들어간건가요?
회원작성글 펄리  |  09.20
Q. 안굳는 MRS agar배지..
잘못 만들어서 그런지 pH 4.7에 검붉게 변한 mrs agar 배지가 실온에서도 굳지 않습니다 ㅠㅠ 폐기해야하는데 굳지도 않고 그렇다고 폐액으로 버리자니 agar가 있을건데 어떻게 해야할지 모르겠습니다..
회원작성글 않이  |  09.20
Q. 대장균 배양기 생존기간
안녕하세요 일반의약품 항생효과 검증실험을 고등학교 동아리 시간에 진행할려고 합니다. 생리식염수에 10배 희석한 대장균을 LB 배지에 평판도말법으로 도말해 융해한 연고를 종이디스크에 적셔서 배지위에 올려놓고 배양기에 25도 3일간 보관할려고 하는데요 9월 30일(금)에 진행하는 거라 10월 3일(월) 휴일까지 생각하면 총 4일간 배양기에 보관해야 되는데 4일이나 배양기에 넣어두면 대장균은 이미 죽어있을려나요...? 오늘 동아리담당선생님께서 대장균을 구입한 상황이라 실험날짜를 미루기는 어려울 것 같습니다.  대장균이 4일간 살아있을려면 어떻게 해야하는지 구체적으로 알려주세요ㅠㅠ
회원작성글 기장의삶  |  09.20
Q. 개초보대학생이 전기영동 분석에서 질문드립니다...
일단 본격적인 질문에 앞서 본인 개초보 대학생임을 밝힙니다.... 질문 수준이 경악스러워도.....너그러이 양해 부탁...드립니다 Q1. 플라스미드 DNA에 제한효소 2개를 처리했습니다. 그 2개가 인식하는 부위가 각각 하나씩이라면 원형의 플라스미드 DNA가 두 덩어리로 쪼개지는 것이 맞는지...? 그리고 그 두 덩어리가 전기영동을 했을 때 길이가 긴 순서대로 위에서 아래로 band형태로 배치되는 것이 맞는지....? Q2. 제가 실험을 했을 때 이론상 길이가 짧은 밴드 길이가 원래 28bp가 나와야하는 것 같은데 실제로 실험을 해보니 480bp로 너무 원래 나와야할 것 같은 길이보다 크게 나왔습니다.플라스미드DNA와 제한효소, 완충액 등을 섞는 과정에서 상당히 많이 기포가 생겼었던 거 같은데, 이게 실제로 나와야 하는 band의 길이와 개수에 영향을 줄 수 있는지...? 기포 이외에 이러한 수치에 영향을 줄 수 있는 요인에는 어떤것이 있을지가 궁금합니다....   미리 답변 감사합니다...
회원작성글 아야어여  |  09.19
Q. annecxin v apoptosis assay 첨부파일
안녕하세요  annecxin v를 이용한 apoptosis assay에서요 flowcytometry를 진행한다음 그래프에서 기준선을 잇는게 임의로 지정하는건지 궁금합니다. 사진의 빨간색 박스로 되어있는부분이 기준선입니다. 지금 annecxin v의 기준선은 10^4에 되어있는데요 다른 논문의 결과를 보면 10으로 되어있어서요...
회원작성글 까오낫  |  09.19
Q. signaling pathway figure는 어떻게 해석해야 하나요?
예를 들어 설명드리자면 signaling pathway를 나타낸 그림에서 "A → B ⊣ C 라고 표시되어 있고, A는 B를 활성화시키고, B는 C를 억제한다." 라고 설명되어 있을 때, A protein의 phospho form이 B를 활성화 시키는 것인지, dephospho form이 B를 활성화 시키는 것인지, 활성화된 B protein이 C protein의 기능을 억제하는 것인지, 정확히 무엇을 억제하는 건지 등의 세부 정보는 어떻게 알 수가 있을까요?  이런 정보들이 기술되어 있는 자료도 있지만, 그냥 단순히 활성화한다고만 기술된 자료들도 많아서 많이 헷갈리는 상황입니다 ㅠㅠ   참고로 저는 autophagy signaling pathway와 PI3K/AKT/mTOR pathway에 대해서 찾아보는 중입니다! 조언 주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠ
회원작성글 가우미  |  09.19
Q. 캡사이신 표준품 문의
안녕하세요 HPLC를 배우는 고등학생입니다 HPLC와 라면을 이용하여 식품공전에 나와있는 캡사이신 정량시험을 하려고 합니다. 캡사이신 standard를 만들기 위해 표준품 소량이 필요한데 어디서 구매할 수 있을까요?
회원작성글 현호  |  09.19
Q. 세포 normalize를 어떻게 할까요
A와 B 세포가 있습니다. 서로 세포의 종류가 달라요 (A: 신경, B:면역). 크기도 다릅니다. metabolite를 비교하려고 세포 5,000개 당 glucose oxidase를 측정하려는데, A와 B의 갯수가 동일하다는 normalize를 어떻게 할 지 고민됩니다. WST 같은 시약을 사용하기엔, A와 B의 mitochondria 탈수소효소가 동일할 거란 보장도 없는데.. counting으로만 제시하기엔 아쉽습니다. 좋은 방법 있을까요?  
회원작성글 모자  |  09.19
Q. Caco-2 cell 배양 관련 첨부파일
한국세포주은행에서 caco-2 cell을 분양받아, MEM, FBS 10% NEAA 1% penicillin streptomycin 1% 로 계대배양 하였습니다.   계대한지 이틀정도 지났는데도 부착되지 않은 세포들이 반 가까이 되는것 같습니다. 세포주은행에서 분양받은 것을 관찰한 것과 계대 후 관찰한 것의 세포 모양 크기가 너무 많이 나서, 걱정되는 마음에 글 작성하였습니다. 확인 부탁드립니다...
회원작성글 doxxx  |  09.19
Q. 혐기성 박테리아 plate 보관방법
안녕하세요, 완전혐기성 박테리아를 키우고 있는데 궁금한 점이 있어 질문 올립니다. plate에 키우고 나서 그 plate를 보관하고 싶은데, 완전혐기성이라 어떻게 혐기환경을 유지시키면서 보관해야하는지 잘 모르겠습니다.   찾아보니 anaerobic pouch 라는 제품이 있던데, 이 파우치에 plate를 넣어 잠근 후 냉장보관 하면 될까요? 파우치를 jar 안에 넣지 않고 그대로 냉장 보관해도 되는지 궁금합니다. 혐기 박테리아 키우시는 분들은 plate를 어떻게 보관하시나요?   감사합니다.
회원작성글 kkykk  |  09.19
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