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BioLab 최수진 교수
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 카테고리: 전체 > Plant Biology > Transformation
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Q. Agrobacterium 배양에 대해 질문합니다.
Agrobacterium 배양에 대해 질문드려요transformation을 위해 LB배지에 28도, 250rpm, 36시간 배양을 하는데요..배양이 되고나서 원심을 하면 계통에 따라 점성이 다르거나 약한것같아요그리고Agrobacterium을 배양할때 쓰는 액체배지는LB배지보다 YEP배지가 더 배양이 잘되나요?그리고 배양조건은 어떠한 조건이 적절한지좋은 답변 부탁드려요
회원작성글 보로봉봉  |  2012.01.13
Q. plasmid selection
제가 kanamycin을 통해 colony selection을 수행 중인데,kanamycin 농도를 50ug/ml 농도로 agar를 굳혔습니다.그리고 거기에 kanamycin 내성 transformanant를 도말했습니다.아침에 보니 colony가 하나도 없군요.kanamycin 농도가 좀 높을 것 같다는 예상은 했는데 역시나 였네요.위 농도로 굳혀놓은 agar가 많아서 그런데 이 농도에서는 transformation이 잘 된 것도 자라기 힘들까요? 물론 transformation이 안되었을 가능성도 있지만 모두 잘 되었다고 가정하에 이 농도에서는 힘들까요? 아니면 plate을 다시 굳혀야 해서 실험 전 고수님들의 답변 기다립니다.
균주  |  2012.01.11
Q. enzyme activity를 보기위한 chloroplast extraction 실험을 하시는 고수님들 계시는지요^^;;
안녕하세요. 제가 arabidopsis에서 chloroplast를 추출한 경험이 없어 경험이 많으신 고수님께 도움을 드리고 싶습니다~!!!reference는 percoll gradient를 이용한 등밀도원심분리법을 사용하였습니다.관련 경험이 있으신 고수님들 상세한 프로토콜이 혹시 있으신지요...ㅜㅡㅜ감사합니다.
회원작성글 임수연  |  2012.01.09
Q. Bacillus megaterium transformation
안녕하세요. 늦었지만 새해 복 많이들 받으세요.저는 Bacillus megaterium에 Plasmid DNA를 transformation하는 작업을 진행 중입니다.헌데..mobitec이라는 회사의 top-agar를 이용한 transformation으로 진행을 해봤지만좋은 결과를 얻지 못했습니다. 물론 결과가 negative인 것이 다양한 이유가 있겠지만..브릭유저분들께 여쭙고자 하는 것은 혹시 top-agar를 이용하지 않고 b.megaterium에 plasmid DNA를 하는 방법이 있을까 여쭙고자 합니다. b.megaterium은 electrophoration 방법이 효율적이지 못하다는 글도 본 것 같은데..고수분들의 도움을 부탁드립니다. 
Bacillus  |  2012.01.04
Q. Cloning 전체 과정...뭐가 문제죠?
1. VECTOR    Plasmid DNA mini-prep: general method. [150-200 ng/ul of plasmid DNA] 2. INSERT    PCR: 1ul of plasmid DNA or cDNA amplify 30 cycles -> PCR purification kit (QIAGEN) [30-50 ng/ul of fragment DNA] 3. Restriction E digestion    vector 2ug of DNA @ 37'C 3hrs   insert 1ug of DNA @ 37'C Overnight 4. Gel extraction    Gel extraction kit (QIAGEN)    -> vector: 25-30 ng/ul, insert: 20 ng/ul 5. ligation    molar ratio vector : insert = 1:3 or 1:5 or 1:9 6. Transformation    5 ul of ligation products to 50 ul C.cell 7. colonies 4 - 5 colonies are observed. (no colonies on negative control plate)마지막에 4  -5 개 콜로니가 정상인가요? 위에 있는 매 과정 마다 농도들이 정상인지..궁금합니다..ㅠ 죽겠네요..
빛의사람  |  2011.12.29
Q. competent cell DH5alpha efficiency에 대한 질문입니다.
ligation product의 정확한 농도는 짐작할 수 없지만 대락 20ng정도라고 하고,ligation의 total volume을 10ul로 실험하였을 때, DH5alpha competent cell을 50ul 넣어 주었을 때와 ligation product의 농도는 같고 total volume이 50ul이고com. cell이 50ul였을 때의 efficient가 같은지 궁금합니다.그리고 com.cell의 efficient를 결정하는 요인이 com.cell의 농도 (cfu/ug)에 의한 것인지아니면 transformation할 때 ligation product와 com.cell의 total volume에 의해 결정되는 것인지 궁금합니다.
실험중  |  2011.12.27
Q. colony 보관하는 방법!
안녕하세요지난주에 막 transformation을 시작한 초보자입니다. plate에서 잘 자란 colony를 보관하는 방법 여쭤보고 싶어서요~일부는 실험에 쓰고 일부는 보관하고 싶습니다.제가 듣기로는 miniprep kit으로 다시 vector만 보관할 수 있다고 들었는데, 주문하면2~3주 걸린다고 해서, 오늘이나 내일 당장 할 수 있는 방법은 없을까요?plate채로 냉장보관하거나 glycerol을 섞거나 하는 방법도 있다고 하던데.... 선배님들 경험 부탁드립니다. 감사합니다!
초보자  |  2011.12.21
Q. transformation 할때 37deg 배양기에 습도는 어느정도로 맞춰야 하나요?
transformation 할때 37deg 배양기에 습도는 어느정도로 맞춰야 하나요?혹시 몰라서 배양기 바닥에 있는 plate에 물을 좀 놔 뒀는데 상관없나요?
궁금해요  |  2011.12.21
Q. Phenol cracking 후 electrophoresis 결과입니다 첨부파일
안녕하세요 실험입문자입니다E.coli를 heat shock method로 transformation하여 phenol cracking한 후 electrophoresis를 해봤는데요보여야 할 plasmid가 안보여서 질문드립니다.Phenol cracking을 하기 전 colony를 LB-Amp plate에 streaking을 했더니정상적인 실험 결과처럼 생존하길래 당연히 electrophoresis 후 plasmid가 나올줄 알았습니다만...electrophoresis 후 확인해 보니 DNA와 RNA 사이에 나와야 할 plasmid가 없었습니다. 정말 plasmid가 없었다면 LB-Amp plate에서 살아남지 못했어야할텐데어떻게 살아남은건지 설명할 방법이 없네요.지금 가능한 추측으로는 streaking 과정 중 자체적으로 Amp 내성을 가진 다른 세균에 오염됬다는 것인데 어떻게 생각하시나요?Plasmid가 사라질만한 원인을 알고 싶습니다.또한 실험이 실패했더라면 transformation된 plasmid 없이 LB-Amp배지에서 살아남은 colony는 어떻게 설명가능한지 알고싶습니다. (참고로 Amp의 활성은 검증된 상태입니다)
구름땅하늘  |  2011.12.11
Q. protein expression 이 되질 않아요 ㅠㅠ
안녕하세요 교수님께 받은 p DNA  1-90 을  PRIMER 를 제작해서 1번부터 100 번 으로 만들기 위해 PCR 한후  pnk  reaction 을 거쳐  self ligation 을 하여  dh5 알파에 transformation 하여 sequncing 이 일치 하는것을 확인 하였습니다. 이걸다시 bl21 (de3) 에 transformation 하여  그 colony 를 LB 10 ml에 키우며 iptg induction test 를 하는데   induction  이 되질 않습니다.control 로 사용한 다른 protein 은  induction 이 되었지만 제가 만든 protein 만 되질않네여 많은 글과 답변들을 검색해보며 codon  usage 라는것을 알게되었는데 그렇다고 하기에는    1번부터 100번 을 pcr 할때 template으로 쓰였던 1번부터 90번 까지는 expression 이 잘됩니다..ㅠㅠexpression time 과 iptg 농도 바꾸어 보았지만 똑같이 되질않습니다..sequncing 이 100% 일치하고 또한 1번부터 90번까지는  발현이 잘되는데그뒤에 10개의 nucletide 때문에 발현이 안될수도 있는건가여??답답하네여 도와주세요 ㅠㅠ  
초보대학원생  |  2011.12.11
Q. transformation 후 miniprep시 vector보다 작은 사이즈의 밴드가 나와요
insert와 vector를 transformation 후 colony를 접종하여 miniprep 하였는데 vector보다도 작은 사이즈의 밴드가 나와요self ligation도 아니고 insert 크기도 아닌데......one band로 나타나는데 여러 크기의 insert를 각각 transformation하고 있는데 다 각각의 본래크기와는 상관없는 밴드가 나왔어요 insert의 사이즈가 크다고 전기영동상의 밴드(알 수 없는 밴드)사이즈가 좀더 크게 나오는 형태는 아니구요도와주세요ㅠㅠ
회원작성글 라니  |  2011.12.08
Q. TA-vector cloning 에 대해서...
안녕하세요?PCR products를 TA-vector에 Cloning하려고합니다. 실험군에는 PCR products, TA vector, and buffer를 넣었고요.control에는 TA vector와 buffer만 넣었습니다. 그리고 E. Coli에 transformation 했습니다.실험군은 Lawn 처럼 colonies가 떴고요, control 즉 vector만 들어간 것도 colonies가 떴습니다.제 생각엔 무조건 vector control은 colonies가 뜨면 안 될 것 같은데요.문제가 뭘까요?도와주세요. 고수님들
hES  |  2011.11.21
Q. plasmid 전기영동과 관련해서(supercoiled 되었을 때에 얼마나 band의 이동이 있는지)
제가 이번에 다른 랩에서 plasmid를 받았습니다.size가 9600bp정도 되는 plasmid 입니다.그런데 배달되어서 오는 길에 튜브가 터져서 다 말라버렸길래DW로 tube 벽을 씻어서 XL1 blue에 transformation 시켰습니다.그 결과 colony들이 많이 나와서 우선 mini prep을 해서 size를 확인해봤는데요,원래 DNA construct가 없기 때문에 이 자체만 가지고 이것이 size가 맞는지 잘 모르겠습니다.원래 size는 9kb 정도인데, ladder와 비교해보면 size가 6kb 근처에서 나오거든요, (아주 희미하게 9kb 원래 size 근처에도 band가 있긴 합니다)이것이 supercoiled 되어서 size가 3kb 정도 이동을 한 것이라고 봐도 되나요?알려주세요, 고수님들,
왕초보  |  2011.11.18
Q. {클로닝 관련] cell harvest는 많이 되는데 mini prep하면 DNA농도가 안나와요.
클로닝은 제대로 모르는 1인 입니다.구입한 COM CELL에 transformation--> colony를 배양하고 test tube에 접종하여 16시간 배양하였습니다.(growth는 엄청 많이 잘~ 됩니다.)그런데 mini prep해서 NANO DROP 체크시  농도가 안나와요. 곡선은 정상으로 나옵니다. 도와주세요.
구름들꽃  |  2011.10.31
Q. transformation은 one DNA per one E.coli?
Transformation에 관한 원리를 알고 싶은데요E.coli  cell 하나당   DNA하나만  들어가는건가요  아니면   여러개의 DNA가 한꺼번에 들어가는건가요?
Jennie  |  2011.10.26
Q. yeast two hybrid질문
arabidopsis 유전자를 사용해 Y2H를 하였는데 pGBK7 vector에 유전자를 넣고 스크리닝을 통해서 interaction하는 유전자를 찾았는데, 이 중 transcription factor의 경우 interaction을 하지 않아도 나올 수 있는건가요?
으아ㅏㅏ  |  2011.10.23
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