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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > etc.
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Q. Taqman PCR product TA cloning
현재 miRNA에 대해서 연구하고 있는 중입니다.     Taqman probe 로 PCR을 하고 PCR product를 sequencing을 하기 위해 TOPO-TA cloning을 해야하는데 혹시 해보신 분 있으신가요?    일반 PCR product 로는 해봤으나 Taqman PCR product로 해본 적이 없어서.. 혹시 그냥 PCR product 하듯이 하면 되는건가요? 
회원작성글 VIL48  |  2020.03.31
Q. 실험 Q&A의 취지에 맞지 않아 글이 수정되었습니다.
BRIC 실험 Q&A 관리자 입니다.    작성해주신 본문의 내용이 실험 Q&A의 취지와 맞지 않다고 판단 되었습니다.  따라서 글의 내용을 수정하였습니다.    의견이 있으시면 member@ibric.org 로 연락을 해주시기 바랍니다.    감사합니다. 
회원작성글 minhoshin  |  2020.02.27
Q. qRT-PCR에서 CT값 관련 질문입니다.
qRT-PCR 결과 분석할 때 같은 샘플의 CT값 간의 차이가 0.5이하로 되어야 한다고 배웠는데 왜 0.5인지 궁금해서 질문드립니다. 
회원작성글 법의학  |  2020.02.13
Q. RNA의 정량 측정 값과 전기영동 결과가 다른 이유가 뭔가요?
샘플 3개에서 RNA prep을 통해 RNA를 뽑아내고 정량을 하였는데 샘플 1번은 580, 2번은 1500, 3번은 47ng/µ정도의 값이 나왔습니다. ratio는 모두 1.9~2.0사이였습니다. 그 후 각 샘플을 전기영동으로 확인해 본 결과 샘플 모두 밴드가 3개 나왔고 정량값으로 보면 제일 어두워야할 샘플 3번이 가장 밝게 나왔습니다. 정량하는 과정 자체에서 문제가 있는 걸까요 아니면 다른 문제가 있는 걸까요?  
회원작성글 핑핑이  |  2020.02.13
Q. RACE-PCR 질문드립니다 ㅠㅠ 첨부파일
RACE-PCR 을 잘 몰라서 질문 올립니다ㅠㅠ Primer design, cloning and sequencing of CagC3 A pair of degenerate primers (CagC3F and CagC3R) was designed to obtain the internal region of CagC3 according to the conserved sequence of complement C3 homologs from other fish [common carp C3-H1 (GenBank accession number BAA36619.1), common carp C3-H2 (BAA36620.1), common carp C3-S (BAA36621.1), and grass carp C3 (AAQ74974.1)]. To obtain the full-length cDNA of CagC3, rapid-amplification of cDNA ends (RACE)-PCR was performed using the Clontech SMART cDNA synthesis kit (following the manufacturer’s instructions) to identify the 5′- and 3′- regions of CagC3. Four specific primers were based on the amplified partial Gibel carp C3 sequence described above. Using nested PCR, primers 3F1 and 3F2 were used for 3′-RACE and 5R1 and 5R2 for 5′-RACE. To confirm the resulting full-length cDNA sequence of CagC3, specific primers (C3F/C3R) were designed. All the primers used in this study are listed in Table 1. Total RNA was isolated with Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in accordance with the manufacturer’s instructions. Residual DNA was removed by DNase I (Invitrogen) treatment. First strand cDNA was synthesized using Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) and stored at −20°C. cDNA was used as template in 50-µl PCR reactions; the PCR cycling conditions were: 30 cycles of 94°C for 10 sec, 60°C for 30 sec, and 72°C for 45 sec. The PCR products were purified using the Wizard® SV Gel and PCR Cleanup System (Promega, Madison, WI, USA), ligated into vector pMD19-T (TaKaRa, Dalian, Liaoning, China) and then transformed into Escherichia coli DH5α competent cells. Five randomly selected clones were sequenced by Beijing Tianyi Huiyuan Bioscience & Technology Inc. (Beijing, China). 이 논문에서 다른 어류 유전자를 참고하여 3F1 5R1 3F2 5R2 프라이머를 만든 후에 CagC3 를 RACE-PCR 돌려서 나온 cDNA 를 위 3F1 5R1 3F2 5R2 프라이머로 nestedPCR을 한다는건가요? 그럼 C3F C3R 프라이머는 어디에 쓰는건가요??? ㅠㅠ 정말 헷갈려서 도움 부탁드릴게요
회원작성글 Weierstras..  |  2020.02.11
Q. 간암 세포 cell line에서 qRT-PCR 결과 cell line별로 peak이 달라요
간암세포에서 타겟하는 유전자를 qRT-PCR로 확인하기 위해서 primer로 HCC cell line(Hep3B, Huh7, PLC, SNU423, SNU449, SNU475, SNU368, SNU398)과 NC(MIHA, THLE)로 qRT-PCR 진행했습니다. 그런데 Hep3B, Huh7, PLC, MIHA에서는 증폭이 잘 안되는 2peak이 뜨고 나머지 cell line에서는 1 peak으로 잘 증폭되는 것을 확인했습니다. 또한, 간암조직에서도 qRT-PCR 진행했는데 Tumor에서는 one peeak이 뜨고 non-tumor에서는 증폭이 낮게 2 peak이 나타났습니다. 샘플이 조직일 경우, 조직이라는 특정때문이라고 생각했는데, cell line에서 cell 별고 다른 결과가 나오는 것을 보고 의문이 생겨서요 cell에서 RNA 뽑고 cDNA 합성해서 qRT-PCR 결과, cell 별로 peak이 다르게 나오는 경우가 있나요?  
회원작성글 ymk8028  |  2020.01.16
Q. qPCR metling curve 질문드립니다 첨부파일
qPCR 멜팅 커브 그래프가 저렇게 나왔습니다  픽은 77로 다른 프라이머들에 비해 빨리 멜팅 되었구요...  딱히 다른 프라이머들보다 길이가 짧다거나 GC 값이 높다거나 이런 특이성은 없었습니다.. ㅠㅠ  두 가지 의문점이 남습니다... 1. 비슷한 프라이머들에 비해 77도에서 빨리 멜팅된 이유는 뭐가 있을까요?  2. 멜팅이 빨리 되었다고 해도 그래프가 깔끔하면 좋은데 픽을 찍고 그 뒤도로 작게 한번 더 굴곡이 생긴 건 어떤걸 의미하는건가요?   발그림 죄송합니다 ㅠㅡㅜ
회원작성글 밍맹뭉  |  2020.01.10
Q. qPCR Ct value 관련 질문있습니다.
endogenous하게 발현되는 특정 유전자를 확인하고자하는데 이게 샘플마다 Ct value가 많이 다르게 나옵니다.   Target GAPDH vector 1st 27.82 15.19 vector 2nd 28.42 14.99 vector 3rd 30.11 14.95 vector 모두 HeLa 세포이며, myc-vector가 transfection된 상태입니다. 그러니깐 endogenous RNA level을 확인할 수 있구요. qPCR 40cycle로 실행했으며 GAPDH는 괜찮다고 보여집니다. 문제는 target RNA 발현량인데요 40 cycle로 돌렸을때 Ct value가 35로 나온다면 저는 RNA 발현이 없다고 판단합니다. 하지만 현재 Target RNA는 분명히 발현이 되는것으로 보입니다. 하지만 같은 세포에 같은 조건으로 transfection된 세포들이구요. 차이점은 세포 passage만 다르다는겁니다. (이건 RNA 발현에 큰 영향을 미칠것으로 생각하지 않습니다.) RNA degradation이라고 하기에는 GAPDH 레벨도 안정적이라 RNA 자체, 그리고 정량에는 문제가 없어보입니다. 이전에 했던 실험에서도 Ct value variation이 컸습니다. 27~35로 같은 세포에서 나온 결과라고 생각되지 않을 정도입니다.   Ct value가 낮긴하다 그래도 40 cycle로 돌렸을 때 27이 나온다면 분명히 발현이 된다고 여겨지는데 어째서 샘플마다 발현량 차이가 크게 나오는걸까요..?    
회원작성글 아이스티  |  2020.01.09
Q. RT pcr 결과 질문 요청드립니다! 첨부파일
안녕하세요 대학원 재학중인 학생입니다. rt pcr을 진행 후 결과를 얻었는데, 그래프의 결과가 이해가 안돼 질문 올립니다. rt pcr은 로그 그래프로 증가 곡선을 나타 내야 하는데 중간중간 끊기는 양상이 관찰됩니다. 무슨 이유 때문인지 조언 부탁드립니다 감사합니다!
회원작성글 돼지의삶  |  2019.12.23
Q. RNA 전기영동 밴드 양상 첨부파일
protocol대로 실험을 진행하였고, 전압기 방향도 맞게 하였습니다. 그런데 결과가 이렇게 나왔어요 밴드가 왜 위로 올라갔는지 모르겠어요 전압 80V 1h run하였습니다.
회원작성글 뚭  |  2019.12.11
Q. microRNA를 희석해야하는데 어떻게 해야하는지 부탁드립니다.
  microRNA를 연구하는 학생입니다.  저희가 microRNA를 마우스에 주입하는 실험을 해야하는데 어떻게 희석을 해야하는지 잘 모르겠어서 여쭤봅니다.    저희가 microRNA (22 nt, WM 6572.2) 250 nmol 을 가지고 있습니다.  그런데 이 microRNA를 5ug/ul 가 되게 희석을 하라고 그러는데 어떻게 희석을 해야하나요?   
회원작성글 VIL48  |  2019.10.31
Q. unbiased screening?
    안녕하세요, 논문에서 unbiased RNAi screening 기법을 사용 했다고 나와있는데,   읽어봐도 확실한 개념이 서질 않아서 구글을 비롯한 사이트에 찾아보고   관련 논문도 찾아보고있는데요,   명쾌한 해설이 없어서 브릭에 질문드립니다.     unbiased라는 단어가 편견없이 뭐 이런 뜻인데   쉽게말해 전체 샘플을 스크리닝 한다는 건가요? 특정 타겟을 하는것이 아니라   샘플속 모든 rna를 관찰한다는 개념 맞나요?   스크리닝을 한 실험들은 많은데 unbiased라고만 되어있고 자세한 설명이   없어서 질문드립니다. 도와주세요.        
회원작성글 실험실지박령  |  2019.10.11
Q. qRT-PCR과 RT-PCR의 차이점
qRT-PCR(real time PCR)과 RT-PCR(reverse transcription PCR)의 정의와 차이점이 정확히 뭔가요?.. 인터넷에 쳐봐도 명확한 답을 얻지 못해서 너무 답답합니다 둘다 mRNA의 양을 확인하기 위한 것이고, RT-PCR은 cDNA를 이용해 측정한다 정도로만 알고있습니다.. 원리도 간략하게 알려주시면 감사하겠습니다
회원작성글 예술  |  2019.10.06
Q. mock과 scramble siRNA의 차이점
transfection 실험 data에서 mock과 scramble siRNA가 있는데, mock은 공벡터를 넣어준것을 의미하고, scramble siRNA는 아무 영향을 주지않는 siRNA를 넣어주는 것이라고 알고있습니다.두개 다 같은 의미인 것 같은데 이 두개의 실험요소를 넣는 이유가 뭔가요? 실험결과 그래프상 scramble siRNA를 넣은 경우 mRNA 발현이 mock에비해 낮게 나오는데 왜 그런가요..? 
회원작성글 a4049b  |  2019.10.05
Q. 논문 용어 질문 (siRNA)
논문읽다가  이해가 안가서 질문드립니다. siRNA knockdown이라는 말이 나오는데, 이 용어가 의미하는게 무엇인가요? 저는 siRNA를 knockdown 시켰다는 의미로 이해해서 siRNA를 knockdown시키면 오히려 유전자가 더 많이 발현되는것으로 이해했는데 논문의 주제와 문맥상 유전자발현이 억제된다고 해석해야 맞게 해석이 됩니다. 만약 A라는 유전자가 있다고 가정할때, siRNA knockdown of A라고 나와있으면 A를 siRNA를 사용하여 knockdown시켰다고 이해하면 될까요? 그리고 figure에 mock, siRNA ctrl, A(대상유전자) siRNA 이렇게 나오는데 mock은 아무것도 처리하지 않은것, A siRNA는 A유전자발현을 억제시키기위해 넣은 siRNA로 이해했는데 맞나요?  siRNA ctrl은 무엇을 의미하는지 알려주시면 정말 감사하겠습니다..
회원작성글 a4049b  |  2019.10.03
Q. RNA 모양, 입체구조
RNA 단일가닥을 모형으로 만들었을 때 아래 보이는 것처럼  DNA와 비슷한 나선 형태를 갖게 되나요? 출처: https://cafe.naver.com/enzymeplus/1486 일직선으로 존재한다는 내용도 봤었던것 같아서요.   그리고 mRNA에 attenuator stem loop가 생기게 되면 right handed helix curve가 나타나나요 아님 left handed helix가 나타나게 되나요?
회원작성글 starter  |  2019.09.24
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