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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. 웨스턴 로딩
궁금한게 있습니다.    웨스턴 로딩할때 그룹이 여러개가 있다면  그룹별로 로딩하면 안되는건가요?    예를 들어서, n=3이고 농도가 3개라면  N1N2N3/C1C2C3/S1S2S3로 해야되는지 N1C1S1/N2C2S2/N3C3S3로 해도 되는지 궁금하네요   
회원작성글 졸려요  |  05.16
Q. W/B에 사용하는 p65 / p-p65 antibody에 관하여.
앞전에 관련 Antibody 사용목적에 관해 질문을 드렸었습니다. 그 질문의 요지는 translocation된 p65는 phospho type이냐 아니냐 였습니다.   제가 아는 signalling pathway는 p65의 ser536 위치가 인산화되며 translocation되는 것으로 알고 있었습니다. For example, phosphorylation at the serine 536 position is required for nuclear translocation while phosphorylation of serine 529 affects transcriptional activity and serine 276 is involved in co-activator recruitment at target gene promoters (Mattioli et al., 2004; Wang and Baldwin, 1998; Zhong et al., 1998). (관련 문헌) 그러나, 많은 분들이 phospho p65를 사용하여 관찰을 할 때는 whole protein에서 NF-kB의 activation를 보고자 사용하는 것 같더군요. 즉, IkBa의 인산화 이후 이것이 deradation되고 translocation 되기전 인산화를 수행한 후 이동하기 때문에 이것을 확인하여 NF-kB의 활성을 확인할 수 있는 것으로 알고 있습니다.   그래서 드는 궁금증이 1. nucleus에서 존재하여 transcription factor로 작용하는 p65는 phosphorylation 되었는가? 2. 만약 되었다면 일부 residue만 되었기 때문에 W/B시 Antigen/Antibody binding motif와는 관련이 없어 normal p65 antibody로 nucleus의 p65를 확인할 수 있는 것인가? (2번과 같은 질문을 한 이유는 저희 실험실에서는 nucleus의 p65를 normal p65로 확인하기 때문입니다.) 워낙 잘 알려진 pathway이면서 오래 연구된 signalling임에도 불구하고 위와 같은 질문들이 브릭에 많았지만 답변이 없는 것 같아 혹시 도움이 될만한 paper나 알고계신 점을 말씀해주시면 감사하겠습니다.  
회원작성글 도도형  |  05.12
Q. W/B Cytosol과 nucleus에서 NF-kB p65를 볼 때 질문입니다.
안녕하세요. 실험을 하다 궁금점이 있어 질문을 드리게 되었습니다. 세포의 NF-kB를 fraction (cytosol/nucleus)으로 나누어 Western blot으로 볼 때 p65의 translocation된 정도를 잡을 때 cytosol에서 p65 antibody와 nucleus에서 p-p65 antibody로 잡지않고 모두 p65 antibody로 잡는 이유가 무엇인가요?   제가 알기로는 NF-kB activation이 됨과 동시에 p65의 Ser 536 위치가 phosphorylation되면서 translocation 되는 것으로 알고 있습니다. 이 때 핵내로 이동하는 p65의 경우는 인산기가 제거되면서 이동하는 것인지 또는 별도의 event에 의해 인산기가 사라지는 것인지 궁금하여 질문을 남깁니다.  
회원작성글 도도형  |  05.12
Q. 웨스턴 블랏 로딩 할 때 질문이 있습니다
Protein 정량 후에 단백질, DW, 5X Sample buffer를 정해진 양에 맞추어서 분명히 넣고 voltex를 한 후 100도씨에 5분 가량 끓입니다.  그 이후에 ice위에서 cooling 한 후 (또는 냉장고에 놔두기도 합니다) centrifuge로 spin down을 살짝한 후 로딩을 하면 예를 들어 볼륨을 30 ul 으로 잡아서 만들었는데 28 ul 정도로 볼륨이 적게 있거나 볼륨이 30 그대로 있는 샘플도 있고 도대체 문제가 무엇인지 모르겠습니다 ㅜㅜ 
회원작성글 쥬뗌므  |  05.10
Q. Transfection할 때 FBS가 이를 저해하나요?
Transfection을 이제 막 배우기 시작하는데 궁금한게 있어 bric에 여쭤봅니다..  먼저 전날에 cell이 6~70%가 차도록 culture하고  다음날 transfection 3~4시간 전에 opti mem으로 media change를 해주는데 이때 opti-mem을 넣는 이유가 FBS가 없어서 라는데 검색했을 땐 FBS가 transfection을 저해한다고 하는데 어떻게 저해하는건지 궁금합니다..! 또, western blotting할 때 serum에 단백질성분 때문에 노이즈가 나타나서 이를 예방하기 위해 serum-free media인 opti mem을 사용하는 것일지도 궁금합니다. 아 그리고 세포 성장에 필수적인 FBS를 제거함으로써 transfection 하는 동안 cell이 overgrowth를 방지하기 위함도 있을까요?
회원작성글 애월  |  05.09
Q. exosome 보관법에 대한 질문입니다.
현재 석사1학기중인 새내기입니다 ㅠ 현재 연구실에서 엑소좀에 관해 연구중입니다. 동결건조된 엑소좀을 가지고 와서 실험중인데 PBS에 희석한 엑소좀을 질소탱크에 보관할 시 protein level등에 문제가 혹시 생길까요? 관련된 논문도 알려주시면 정말 감사드립니다 ㅠ
회원작성글 태태태  |  05.06
Q. WB 할 때와 IP 할 때 protein size가 다릅니다.
안녕하세요, 석사 3차 대학원생 입니다.   Western blot은 오류가 생겼을 시 스스로 해결방법을 찾을 수 있을 정도의 실력이 되었으나 IP는 제대로 된 결과를 본적이 없어 아직도 미숙한 상태입니다.   현재 보는 protein의 sieze는 100~115kDa로 9% gel에서 보면 marker의 100-140 사이에 보입니다. (140에 조금 더 가깝게 detection 됩니다.) 그러나 IP를 하면 100보다 아래 detection 됩니다.  heavy chain, light chain은 25, 55kDa에서 확인 되었고 100보다 10kDa정도 아래 부근에 어떠한 경향처럼 보입니다. 혹시 IP하면 size가 바뀌기도 하나요??     아래는 저와 비슷한 질문에 달린 답글입니다. ryan  |  2008.08.04            Heavy chain band size와 같은데, 아니라고 하시고, 같이 loading한 WCL에서는 그 band가 없고 원래 band만 있다면, post translational modification을 고려해 보세요. 일단 연구하시는 protein의 post translational modification을 공부해 보시고, 각 경우에서 size가 어떻게 변하는지 확인해 보세요..   저 댓글을 본 후 제가 보는 protein의 PTM에 대해 검색해봤습니다. "Polyubiquitinated following MDP stimulation, leading to proteasome-mediated degradation."   혹시 이게 살짝 낮은 kDa에 detection된 이유일까요..?   WB와 IP결과는 요청하시면 일부분 잘라서 올려드리겠습니다.   감사합니다.
회원작성글 신짜오  |  05.02
Q. western blot 볼 때, 노출 시간이 길어도 blot이 진해지지 않는 현상
안녕하세요, 경험이 많지 않은 석사생입니다. western blot 을 진행하면서 최종적으로 ecl 뿌리고 블랏 확인시에, 10초, 30초, 1min, 5min 이런식으로 blot을 확인 진행하는데요. 최근들어 membrane을 필름에 오래 노출시켜도 진해지기는 커녕, 시그널이 약해지는 현상이 계속 관측되어 실험이 제대로 진행되지 않고 있습니다. 예를 들면, 5sec 노출에서는 밴드가 확인되었으나, 더 진한 밴드를 얻기 위해서 30sec 노출시키거나, 1min 노출시키면 더 진한 밴드가 나와야하는데, 더 연하게 나오는 현상이 많이 벌어지고 있습니다. 원인을 혹시 아시는 분이 있을지요?   
회원작성글 신입입니다  |  05.01
Q. 웨스턴블롯 저분자 단백질이 transfer 되지 않는것 같습니다 첨부파일
멤브레인 폰슈 염색을 진행하면 사이즈가 큰 부분은 잘 넘어가는데, 사진에 네모 친 곳처럼 저분자 부분은 하얗게 빈것처럼 나와 있는걸 확인할 수 있습니다. 버퍼문제인가 해서 sonication 으로 혼합해 보고, transfer 시 위치 문제인가 싶어 멤브레인을 위아래 뒤집어서 해봐도, 저부분만 저렇게 보입니다. 사이즈가 작아서 멤브레인 뒤로 다 넘어가버렸나 싶어서 전압과 시간을 낮춰도 같은 현상이 나옵니다. 실제로 항체를 붙여도 베타아밀로이드 같이 작은 단백질은 검출이 안되고요. 저같은 경험 하신 분 있으신가요, 어떻게 해결해야 할까요
회원작성글 AGCT  |  04.29
Q. sds-page 전기영동 실험 첨부파일
사진은 빵밀 4개 품종(A, B, C, D)에서 분리된 단백질의 글루테닌 단백질 분획을 SDS-PAGE 전기영동으로 전개시킨 겔의 고분자량 폴리펩티드 부분만을 나타낸 것인데, 품종 특이적인 폴리펩티드는 무엇이고, 고분자량 폴리펩티드의 종류가 품종마다 다른 이유는 무엇인지 궁금합니다.
회원작성글 quiokie  |  04.29
Q. sds page 내릴때 dye+sample의 band가 너무 넓게 나타납니다.
안녕하세요. 단백질 실험 쪽은 아직 초보인 석사 대학원생입니다. 저는 현재 3.4K Da의 단백질을 sds-page를 통해 확인하고자 하는데 MALDI-TOF로는 확인이 된 샘플인데 전기영동을 내려보면 위의 사진과 같이 전기영동 내려갈 때 차츰 벌어지더니 끝날 땐 많이 벌어졌습니다.  전기영동 조건은 2X sample buffer와 단백질 sample을 1:1로 섞은 것을 well당 10ul씩 넣어주었고 15% gel에 200V로 내렸습니다. 1. 밴드가 휘어지게 뜬 건 뭔가 gel을 tank에 끼울 때 버퍼가 조금씩 새는데 그걸 제가 캐치를 못한 것 같습니다만... 저렇게 loading dye가 벌어지는 건 왜일까요 ㅠ 2. ladder maker 또한 밑에 내려갈수록 희미하게 뜨던데, 혹시 ladder marker에서 크기가 작은 marker band가 좀 진하게 나오게 하는 팁이 있다면 한 수 가르쳐주시면 감사하겠습니다,,,
회원작성글 와디와디  |  04.27
Q. Western blot troubleshooting 부탁드립니다! 첨부파일
  안녕하세요 이제 갓 입학한 대학원 신입생입니다.   몇달 째 WB을 하고 있는 중인데, 유독 한 antibody에 대한 결과가 잘 나오지 않아 질문 드립니다.   우선 sample은 mouse tissue에서 얻어낸 sample입니다. well 당 20 ul 씩 loading 하고 있고, protein의 양은 12ug으로 동일하게 넣습니다. 1st antibody는 fibronectin (abcam, ab2413)이며 titer는 1:250 으로 사용하고 있습니다.   제가 하고 있는 실험 과정을 쭉 설명드리자면   gel : 1.5mm, 15 well 사용/8% acrylamide gel western blotting loading (Bio-rad) : 60V로 1시간 반~2시간 + 120V로 1시간 transfer (Bio-rad) : 60-80 V, 200-250 mA, 3시간 ~ 3시간 반 blocking : Bio-radd의 every blocking 사용, RT 10분 1st Ab : cold room, 15시간 2nd Ab : RT 1시간 (anti-rabbit으로, titer는 1:5000 사용중입니다) detector : ABfrontier 사의 detector 사용     Wash는 TBST로 5분 씩 3번 해주며, 10분씩 3번 해줄 때도 있습니다.   제가 가장 많이 바꾸는 조건은 transfer 과정인데요, cold room에서 O/N 하면 좋은 결과를 얻는다고도 해서 그렇게도 해 보았는데 Fibronectin은 결과가 잘 안 나옵니다.   또한 어떤 날에는 60 V에서 200-250 mA가 되고 어떤 날에는 80 V에서 200-250 mA가 되어서 최대한 A을 일정하게 맞추려고 voltage 값은 바꾸어 줍니다 (보통 60-80V 사이). 대부분 100 V로도 많이들 사용하시길래 시도해봤는데, gel이 녹고 membrane이 말라버려서 결과가 안 예쁘게 나오더라구요...   우선 경향성 자체는 제가 생각한 대로 1-4번, 7, 8번 lane이 비슷하게 연하고 5, 6번 lane이 진한 것은 맞는데 크기가 245 kDa라 그래서 잘 안 넘어오는건지 자꾸 결과가 안 좋습니다ㅜㅜ 저걸 band라고 봐야할지도 모르겠구요....   2 band인 것은 항상 2 band로 떠서 둘 다 가져가긴 하는데 대체 왜 저렇게 background도 심하고 진한 부분은 번짐이 심한지도 모르겠습니다.   선배님들의 고견을 여쭙고 싶습니다. 감사합니다.
회원작성글 도로도로도로록  |  04.26
Q. 재조합단백질kdal단위 계산하는법
대략8kb 정도되는 재조합 플라스미드벡터인데요  sds-page에 ladder넣고 몇kilo dalton인지 어떻게 계산해야하나요? 인터넷으로 확인해보니 아미노산 평균 분자량110으로 하고 코돈이3으로 나눠야한다는데  재조합 단백질시 몇kdalton인지 계산하는법 부탁드리겠습니다 선배님들 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 
회원작성글 choheec  |  04.25
Q. western blot CD63, HSP70 질문있습니다
exosome characterization을 위해 CD63, HSP70을 이용해서 western blot을 진행하는 중입니다. 저 항체들로 western blot을 진행하면 이상하게 b-actin자리에서 밴드가 나오고 CD63, HSP70 위치에서는 밴드가 나오질 않습니다. 혹시 원인이 어떻게 될까요.. 찾아도 나오지를 않아서 이렇게 질문드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 태태태  |  04.23
Q. mmp-1 양상이 뒤집힙니다
UV 처리 후 mmp-1의 양상을 보기위해 웨스턴 블랏을 진행중인데요, UV- 그룹과 UV+에서 mmp1 양상이 각각 반대로 나옵니다. uv- 그룹이 과발현 되고, 오히려 uv를 처리하면 감소합니다. 다른 셀을 키워도 봤고, 단백질을 다시 뽑아도 봤습니다. 그리고 베타엑틴 확인시 정량에는 문제가 없었습니다. 다만 passage가 30 언저리인데 이러한 경우 mmp 양상에 영향을 미칠수가 있을까요?
회원작성글 졸업시켜줘요  |  04.23
Q. Western blot 을 중간에 멈추는 방법 ?
Western blot을 하려고 하는데  금요일날 running 및 transfer를 하고 TBS-T용액에 membrane을 주말 이틀 간 담궈 놓은 다음  월요일에 1차 항체 붙여도 될까요? 다음 주로 실험을 모두 미루자니 빨리 결과를 보고 싶고, 주말에는 개인 사정이 있어 실험을 못하는 상황입니다ㅠㅠ 
회원작성글 hazzy  |  04.22
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분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
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