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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunofluorescence
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Q. tunel assay protocol에 관한 질문입니다. 첨부파일
로슈에서 키트를 구매해서 mouse ovary 파라핀 조직을 가지고 실험하려고 하는데 로슈에서 제공한 프로토콜을 읽으면서 궁금한 점이 생겼습니다.  라벨링에 있어서 일반 조직과 difficult tissue 의 프로토콜에 차이점이 존재하는데 여기서 difficult tissue는 어떤 조직을 말하는건지 잘 모르겠습니다... 파라핀 조직은 그냥 일반 tissue 의 프로토콜에 따르는 것이 맞는지 궁금합니다.
회원작성글 로슈  |  2018.11.15
Q. cell에 BODIPY-labling 후, 4% PFA fixation하고 보관 시간.
colorectal cell에 BODIPY-labling하고 FACS를 찍어 형광 분석하려고 합니다.FACS 전처리 시, 4% paraformaldehyde로 15min fixation 진행하려 하는데곧바로 FACS를 사용할 수 없게 되어 4days 정도 보관하려 합니다.다른 분들께서는 3-4일 정도는 PBS에서 humid condition에서 보관해도 괜찮다고 말씀하셨는데,fluorescent intensity를 잡으려고 해서, intensity에 문제가 생기지 않을 지 걱정 됩니다.혹시 해보신 선배님들 계신가요??
회원작성글 haerii  |  2018.11.09
Q. IHC를 위한 embedding 과정 질문
4% PFA Perfusion - 조직 적출 후post-fix - 30% sucrose change 과정을 진행 하였었는데지금 현재 실험실에서 4% PFA perfusion 이후 조직을 mold 에 넣고 OCT Compound 를 넣고바로 LN2 에 embedding 을 실시한다고합니다후고정, 30% sucrose 과정이 없이 위 과정으로 해도 조직 staining 에 문제가 없을런지알 수 있을까요?
회원작성글 이겨또  |  2018.11.08
Q. IF(immunofluorescence) 질문
제가 일하면서 실험하다 실수로 fixationn을 먼저 해야하는데 blocking 을 먼저 하고 생각이나서 washing 하고 fixation을 했어요... 근데 이러면 안되는거죠??ㅠ 안티바디를 아낄려면 여기서 멈춰야 할거같은데.. 관련 내용을 못찾겠어서 질문 남겨요.. 고수님들 답변 부탁 드려요ㅠ
회원작성글 판돌판돌  |  2018.10.05
Q. 세포 면적을 재서 통계처리를 하는게 이렇게 계산해도 괜찮을까요?
바이오소재 연구하고 있는 대학원생입니다.재료에 붙은 세포의 면적을 재고 있는데, nuclei, vinculin, actin 이렇게 세가지를 염색해서 세포가 펼처진 면적을 구하고 있습니다.공초점 현미경으로 층층이 찍고 위에서 보는 모습으로 합치고 있는데요, 적게 펼처진 세포랑 많이 펼처진 세포랑 같은 샘플 내에서 면적차이가 심하게 납니다. 4배 정도요..세포는 fibroblast를 쓰고 있습니다.통계데이터를 내려고 여러 장의 사진을 모아서 계속 재고 있는데, 세포 수십개의 면적값에서 하위 20% 상위 20% 이런식으로 데이터의 일부를 제거하고 나머지를 계산해도 상관이 없는지요?세포면적을 계산한 값들을 크기로 sorting하고 제일 큰 값, 제일 작은 값을 지우면서 평균과 표준편차를 구해보니 평균은 크게 안바뀌는데 상위 20%, 하위 20%에 해당하는 데이터를 빼고 계산하면 표준편차가 크게 작아집니다. 너무 작은 값과 너무 큰 값들을 지우면 표준편차가 작은 이쁜 figure를 얻을 수 있을 것 같은데... 문제가 없을까요?제가 data를 cherry picking하고 입닫으면 예쁜 figure를 그릴 수 있겠지만 이건 좀 아니다 싶어 질문드립니다. 현재까지 측정한 바로는 원하는 경향성에 들어맞지만 표준편차가 좀 큰 상황입니다.
회원작성글 Diatom  |  2018.08.22
Q. 논문에나온 내용 형광염색 다시한번 질문더 올립니다.ㅠㅠ
질문하나더 부탁드립니다. 아까 댓글에서 어떤 고마우신 선생님이 co-stain하고 나서 conjugated 한 항체를 따로 염색한거라 말씀하셔서 그건 이해가 됬습니다. 그런데 색깔이 아무리 생각해도 맞지않아서 또 올립니다.ㅠㅠ alexa 488은 green 이고, 555는 주황에 가까운노랑이고, 635는 red라고 알고있습니다.이해가 안되는게 이논문에서는 neun이 red고 gfap가 green이며 iba-1이 blue입니다.iba-1의 출처는 어떻게 되는것인가요..? (blue색은 도대체 어디서 나온건지;;;) 2차 형광안티바디가 전부 555,635, 593 입니다. 그리고 따로 염색을 한다면 같은 2차 항체라도 상관이없는지 여쭙고 싶습니다. 예를들어 mouse- rabbit 먼저 1차 붙이고 2차붙이고.. 다시 워싱해서 mouse 항체 1차를 붙이고 2차를 다음날 붙여도되는지알고싶습니다.꾸벅
회원작성글 이겐  |  2018.08.20
Q. 삼중염색에 관한 논문 해석좀 부탁드립니다. 이해가 안되는게있어요.
위 논문이구요 이논문을 롤모델로하여 gfap iba-1 neun을 염색하고자합니다.제 짧은 지식으로는 2차항체를 각기 다른 항체로 써야하는걸로 알고있는데요위논문보니까  rabbit 이렇게 겹치는게 있고... 도대체 무슨 뜻인지 몰라서 너무나 답답합니다.이분 triple 염색을 어떻게 했는지 가르쳐줄수있을까요..?너무 답답해서 브릭에 올려봅니다. 선생님들 부탁드리겠습니다. 꾸벅
회원작성글 이겐  |  2018.08.20
Q. triple 염색 질문있습니다.
triple 염색할때 질문이있습니다.2차항체를 겹치게 쓸수있는지 궁금합니다.1차 host가 겹치는게 두개있는데 새로 사야할 실정이라서요1차붙이고 2차 붙이고 또 1차 붙이고 2차 붙이고할때 문제가 크게 될까요..?방법이 없을까요...iba-1 gfap neun염색하신 분들의 의견을 듣고싶습니다.. 세개 다 염색시켜야합니다.ㅠㅠㅠ
회원작성글 이겐  |  2018.08.20
Q. 선배님들은 immunofluorescence로 CD marker볼 때 detergent 사용 하시나요?
안녕하세요.현재 대학원생으로 있는 학생입니다.Immunofluorescence 실험을 많이 진행했는데요.제가 알기론 CD marker를 관찰 할 때는 당연히 detergent를 사용 안했는데요. (ex.Triton-X,Tween-20)다른 실험실에서 사용하는 걸 보고 멘붕이 왔네요..제가 이상한 사람인가 하고요..;CD marker는 이름 그대로 세포 membrane에 붙어있는 항원 아닌가요? detergent는 세포에 구멍을 내주어 antibody가 세포내로 들어갈 수 있게 해주는것으로 알고있는데......제야의 선배님들은 혹시 CD marker 볼 때 detergent 사용하시나요?cf. 만약 CD marker랑 세포내 단백질을 merge해서 보고싶은 적은 없으신가요? 그럴 경우 그냥 permeabilization 안하는게 맞겠죠?
회원작성글 coindoll  |  2018.07.13
Q. cryosection 붙인 슬라이드 ihc 방법 가르쳐주시면 감사하겠습니다.
다른과정은 다 문제없는데 mouse brain을 동결절편기에서 슬라이드로 바로 붙여서 30~40um-20 도에 보관한다음 5분간 3번 pbs로 워싱하고 h202 과정에서 기포가 발생합니다.원래 기포발생하는건 맞는건데 이게 조직을 울툴불퉁하게 기포 올라온 흔적이 보여서 너무 지저분하네요..너무 오래간만에 실험하는거라 기억도 가물가물하고.. cryosection 을 microwave citric acid 처리해야만 하는걸까요?너무 퀄리티가 떨어져서 기포발생으로 애를 먹고있습니다. 메탄올에도 100퍼센트에 0.3%~3% 과산화 수소도 처리해봤습니다만..기포는 여전합니다.ㅠㅠㅠㅠ 어떻게해야할까요.ㅠㅠㅠㅠㅠ 고수님들 부탁드릴게요..석사과정때 이런적 없었던걸로 기억하는데..그땐 파라핀이었거든요..ㅠㅠ
회원작성글 이겐  |  2018.06.25
Q. 형광 스캐너 알려 주세요
안녕하세요 짐서방입니다.요즘 형광을 가지고 실험하는데..처음하는 실험이라 모르는것이 고수님들께 여쭈어 봅니다.형광의 정량을 확인 할 수 있을 정도의 스캐너를 구매하고자 하는데브랜드와 가격을 여쭈어 봅니다.아직 초기 단계라 비싼 장비를 살 수는 없습니다.유리 슬라이드 위에 반응 산물을 올려 놓고그 반응 산물의 형광값을 읽어내는 실험을 하고자 합니다.알맞은 장비에 대한 추천 부탁 드립니다.감사합니다.
회원작성글 짐서방  |  2018.06.19
Q. mouse 조직 IHC 할 때, anti-mouse 2nd ab를 세포막 표시자로 쓸 수 있을까요?
문득, 드는 생각인데, mouse 조직이니깐 anti-mouse 2nd ab가 여기저기 다 달라붙을텐데...이거 사용해서 세포 간의 경계선 표현 가능하지 않을까 싶어서요 ㅎ;너무 말도 안되는 상상인가요 ㅎ; 당연히 pub을 위한 데이터는 아니고, 지금 당장 가용한시약이 없어서, 우선 저렇게라도 한 번 해보고 데이터가 나오는지 안 나오는지 보고 싶은데..어떨까요?
회원작성글 더잘하고싶다  |  2018.05.15
Q. immunofluorescence에서 ligand와 receptor binding을 보여주려하는데 도와주세요.
안녕하세요. 현재 특정 receptor와 ligand가 결합하는 것을 immunofluorescence를 통해 보여주려합니다. 특정 cell에 그 receptor에 대한 488-labeling antibody를 쓰고, washing 후 PE-labeled protein을 처리해줄 것입니다. 생각해보니 receptor에 대한 488-labeled antibody가 protein이 binding하는 것을 막을 수도 있을 것 같다는 생각이 들더라구요. 이 protein이 receptor의 어느부분에 붙는지 알면 좋을텐데 거기에 대한 정보는 모릅니다. 이 상황에서 다른 대안을 생각해보고 있는데, 1. receptor가 transmembrane receptor인데, 이들의 extracellular 부분이 아닌 cytoplasmic part에 binding하는 antibody를 새로 구매하여 위의 방법대로 실험을 진행해보는 것-> 이런 경우는 permeabilization과정을 따로 해주어야 하죠? 2. receptor가 CFP를 발현하도록 vector를 design하여 cell에 transfection하는 방법 -> 이렇게 해도 protein과의 binding이 잘 관찰될까요? 제가 생각한 대안은 두가지입니다. 혹시 이러한 방법이 가능할지, 또 다른 대안이 있는지경험자분들의 도움이 필요합니다. 감사합니다. 
회원작성글 thdms0203  |  2018.05.02
Q. fLuc-4T1하고 혹시 DD-her2-neu cell 보유하고 계신 분 계시나요?
안녕하세요.혹시 breast cancer cell line 중 fLuc-4T1,  DD-her2-neu cell  혹시 보유하고 계신분 계시나요.실험에 필요한데, 혹 있으시분 분양 가능한지 여쭙고자 글올립니다.감사합니다.Great2012
회원작성글 Great2012  |  2018.04.25
Q. BDA
anterograde tracer인 BDA 결과를 confocal을 사용하여확인 하고 싶운데 어떻게 하면될까요??ㅠㅠㅠ아니면 나와있는 논문 아시면 알려주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅍㅍㅍㅍㅍㅍ
회원작성글 ㅋㅋ123  |  2018.04.23
Q. 사람 혈액에서 CD19 beads로 분리하여 culture한 다음 CD19로 staining하여 FACS로 분석하는데 왜 CD19 발현된 세포가 별로 없을까요?
 사람 혈액에서 MACS로 CD19 positive selection하여 B cell을 분리한 다음 완전배지에 배양하였습니다.  한 조건은 아무것도 처리하지 않고 한 조건은 anti-CD40 와 CpG를 24h, 48h 처리하여 배양한 다음 anti-human CD19 antibody staining하여 flow cytometry로 분석한 결과 15% 미만으로 나옵니다. 배양하지 않고 바로 분리하여 staining 하였을때는 95% 정도 나오는데 배양하면 왜 CD19 positive cell이 적을까요? 혹시 해보신분 계신가요? 염색이 안되는 것인지 아니면 배양하는것이 문제가 있는지 잘 모르겠습니다. 아시는분 답변 부탁드립니다.
회원작성글 생물전공자B  |  2018.03.30
Q. Immunostaining mounting solution 하기전 슬라이드 말려도되나요?
슬라이드에 cell seeding 후 형광염색해서 보고있는데요, 2차 Ab 붙인 후 wash하고 mount하기전 wash buffer 다 건조시키고 mount 해야하나요? Cell이 마르면 안된다고 알고있는데요..상관없나요?
회원작성글 하하하핳  |  2018.03.02
Q. Immunofluorescence의 washing에서 PBS-T?
 안녕하세요. 한창 immunofluorescence를 진행 중인 석사생입니다. 제가 실험을 배울 때 cell의 receptor에 붙는 marker 같은 경우에는 PBS-T를 사용하지 말고 PBS로만 진행하라고 배웠는데요. CD86과 같은 Cluster of differentiation marker는 그럼 PBS로만   washing 해야 하는건가요? 결과에 background가 많이 나오는 것 같아서 gain값과 offset 값을 조절 하긴 하는데 애초 염색과정에서 PBS-T를 사용하면 깔끔하게 나올 것 같아서 질문 남겨봅니다. 혹여 PBS-T를 사용하게 되었다가 염색이 뻥뻥 뚤린 모양으로 나오면 어쩌죠?... 고수님들의 답변 기다리겠습니다.
회원작성글 coindoll  |  2018.02.14
Q. 형광현미경 결과 첨부파일
LABox #Fluorescence
    안녕하세요 석사 2학기 학생입니다.  최근에 형광현미경을 시작하게 됐는데, 처음하는 것이라 어떻게 IF결과를 확인/해석해야할지 몰라 여쭤봅니다. 저는 세포의 특정 receptor에 dye가 결합한 특정 protein이 결합하는 것을 보려고 합니다.  DAPI, FITC (receptor), Alexa Fluor 555 labeled protein을 이용해 receptor과 protein이 붙는 것을 확인하고 있고, receptor의 경우 primary antibody 1:100, secondary antibody 1:200으로 해주고 있고, protein의 경우 1 ug/ml을 처리해주고 있습니다. 또한 protein의 control로 같은 dye로 labeling시킨 BSA를 이용하고 있습니다. (첨부 사진은 receptor는 labeling하지 않고 protein만을 초록색으로 labeling한 사진입니다.) 형광현미경을 찍었을 때 처음에는 진하게 형광이 나타난 각각의 점 부분(사진의 화살표부분)이 각각 receptor와 protein일 것이라고 생각했는데, 그렇다고 하기에는 세포의 크기에 비추어 봤을 때 점이 너무 큰 것 같아 점이 receptor와 protein은 아닐 것 같다는 생각이 들었고, 그렇다면 cell 형태로 퍼져있는 전체 초록색 혹은 전체 빨간 부분이 다 receptor와 protein일 것이라고도 생각은 해봤지만, 그렇다기엔 cell에 receptor와 protein이 너무 많이 보이는게 아닌가 하는 생각이 듭니다. 아니면 정말 receptor와 protein이 작기 때문에 제가 생각한 것보다 cell에 원래 저렇게 전체적으로 많이 나타나는건가?하는 생각도 들구요..  1. 확실히 사진을 보면 같은 1 ug/ml을 처리한 BSA보다 protein이 같은 Gain값을 주었을 때 더 진하게 보이는데, 이에 의하면 BSA보다 protein이 더 결합한 것으로 볼 수 있는 것인가요?  2. BSA에 비해 protein이 cell에 잘 결합한다는 것을 보여주려면 같은 gain값을 주고, 꼭 같은 효과를 주어야 하나요? 더 선명하게 보이게 하려고 선명도를 높히면 다른 것도 같이 올려줘야 정확한 비교가 되는 거겠죠?  3. 그리고 protein이 그 receptor에 결합한다는 것을 보여주려면 어떤 특정 부위가 merge 했을 때 겹치는 것을 보여줘야 할 것 같은데, receptor와 protein이 cell에 전체적으로 퍼져있으면 당연히 merge 했을 때 그 receptor에 결합하는게 아니어도 색이 겹치지 않나요? protein이 다른 receptor가 아닌 labeling한 특정 receptor에 결합한다는 것을 어떻게 IF로 보여줄 수 있나요?  감사합니다.   
회원작성글 thdms0203  |  2018.02.09
Q. 면역형광염색 질문입니다.
 면역형광염색에서  ihc와 달리 h202 과산화 수소처리를 안하는것으로 알고있습니다이유가뭔가요? 혹시 처리해도 염색에 큰 지장이 있나요?전에 잘모르고 했으나.. 염색은 잘나와서요...답변 꼭 부탁드립니다 ..1차 안티바디 붙이기전 protocol이 어떻게 되는지 알려주시면 대단히 감사하겠습니다.
회원작성글 이겐  |  2018.01.30
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