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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
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Q. RNA washing 후 drying
안녕하세요! 대학원 신입생입니다. RNA extraction 과정에서 가끔 RNA 농도가 낮게 나올때가 있는데, 아마 ethanol 제거 과정에서 RNA 유실이 있는것 같습니다. 일단 프로토콜은 다음과 같습니다. -75% ethanol 1mL 추가 후, vortexing하고 7500g / 7min / 4C 센트리 -상등액은 따라 버리고, 잔여 에탄올은 syringe needle / pipette tip으로 조심스럽게 제거 -10~15분 상온에서 drying 1. 다른 랩 친구들은 vortexing을 하면 RNA pellet이 갈기갈기 찢겨지기 때문에 센트리를 돌려도 쉽게 떨어질거라고 합니다. Inversion mixing을 하면 덩어리로 펠렛이 나와서 편하다는데, inversion mixing으로도 washing이 충분히 되나요? 2. 상등액을 따라 버린 후 짧게 센트리를 돌려서 (1분가량) 남아있는 에탄올을 pipette으로 조심스럽게 제거해봤었는데, 펠렛이 쉽게 떨어집니다. 더 좋은 방법이 없을까요? 3. E-tube 밑부분에 큰 방울이 맺혀있어서 상온에서 말려도 없어지지 않습니다. 온도를 높여서 말리는 건 RNA degradation이 걱정이 되는데, 더 안정적인 방법이 없을까요?  4. 에탄올이 남아있는 상태로 cDNA 합성을 하고, RT-qPCR을 돌리면 RT-qPCR 결과에 큰 영향을 주나요?? 제가 너무 과민반응하는건지 잘 모르겠습니다. 선배님들 조언 부탁드립니다! 감사합니다!! 
회원작성글 wassupyall  |  2020.11.30
Q. RNA 농도측정 관련
안녕하세요 연구초보입니다 RNA를 cell에서 extraction을 trizol을 이용하였습니다. 그런데 마지막 depc water로 rna를 녹여서 나노드랍을 이용해 측정하려고 하는데 잴 때마다 값이 다르게 나오는 이유를 모르겠습니다. 고수님들의 답변 기다리겠습니다.
회원작성글 브루스웨인  |  2020.11.26
Q. RT-qPCR에서 궁금한 것이 있습니다.
 여러 논문을 읽는 도중 RT-qPCR에서 Poly(A)-purified RNA를 사용했다고 나와 있는데요. rna를 정제했다는 것 같은데 Poly(A)-purified RNA가 정확히 뭔가요? 아데닌만 중합되어 있는 RNA인가요?  
회원작성글 adni  |  2020.11.25
Q. disulfide bond 제거 시 어떻게 해야 ethyl acetate를 말끔히 제거할 수 있나요?
disulfide bond 를 이루고 있는 Thiol modificated siRNA를 DTT를 이용해 reduction 시키는 방법까지는 알겠는데... ethyl acetate로 extraction 하는 방법을 도저히 모르겠습니다. ethyl acetate를 pipetting으로 제거하기는 하는데 얇게 남아있는 이 잔여물들을 말끔히 제거하는 방법이 있을까요?   처음 하는 실험이라 너무 힘드네요  
회원작성글 기웃기웃  |  2020.11.19
Q. Virus 검출 목적으로 PCR 할 때 RNA만 추출하는 이유가 궁금합니다.
안녕하세요, 이제 막 연구를 해보려 발을 내딛은 학생입니다. 멍청한 질문이지만 아무 생각없이 선배들 프로토콜을 따라하기 보다는 그 이유를 알고 진행해보고자 질문 드립니다.   바이러스 검출 목적으로 PCR을 할 떄, cell lysis 후 RNA 만 추출하는 작업을 꼭 거친 뒤에야 reverse transcription과 PCR 과정을 거치더라구요. 반드시 순수한 RNA만 가지고 실험해야하는지 궁금합니다.   제 짧은 생각으로는 reverse transcription 할 때는 어차피 RNA만 cDNA를 합성할 수 있으니 byproduct 걱정이 없고  PCR과정에서는 온도를 올리니까 Taq polymerase. 외의 다른 단백질은 변성될텐데,   RNA만 가지고 하는 이유가 정말 알고싶습니다. 감사합니다. 
회원작성글 목스트레스풀때는목캔..  |  2020.11.14
Q. Trizol로 RNA 추출실험 하려는데 세포 말고 돼지고기에서 가능할까요?
학생들 실습을 하고 싶은데 갑자기 CO2 incubator가 고장이 나서 세포를 키울 수 없는 상황입니다. 파프리카에서 DNA 추출실험하듯이 돼지고기를 사용해서 RNA 추출 실험을 할 수 있을까요? 얇게 저민 돼지고기에 trizol을 처리 후 scrapper로 긁어내면 가능하지 않을까 싶은데....무모한 일일까요? 예비실험을 할 예정이긴 한데 일단 가능성을 여쭤보고 싶어 글 올립니다
회원작성글 flightover..  |  2020.11.08
Q. -70도 냉동고에서 보관한 조직에서 RNA 분석 가능할까요??
안녕하세요. 실험실 업무는 한지 얼마 되지 않아 기초 지식이 부족한점 양해 부탁드립니다.   동물 조직을 분석하려 하는데 실험실에 질소 탱크가 없어 conical tube에 pro-prep 또는 trizol에 담아 -70도에 보관했습니다. 조직 크기는 가로세로높이 1~2mm입니다. microarray와 microRNA 정량하려고 하는데 문제 없을까요??   또한 앞으로 microRNA 정량할 계획이 있어서 질소탱크도 구매할 계획입니다. 조직샘플을 어떤 식으로 보관하면 좋을지 조언해 주시면 감사하겠습니다ㅎㅎ
회원작성글 너구르  |  2020.11.07
Q. RNA추출 후 전기영동 결과(사진) 첨부파일
미천한 학부생이 실험결과가 이해되지 않아 질문드립니다 HEPG cell에 ERR gamma를 transfection하여 Tri-RNA reagent, Chloroform,  Isopropyl, DEPC water을 이용하여rna를 추출하였습니다. 1%아가로스겔로 전기영동을 내렸습니다 사진에 보이는 띠중 맨 아래띠는 5srna 인 것 같습니다만 왼쪽부터 1번의 띠가 왜 하나만 나온것인지, 2번의 띠는 2개가 보이지만 1번과 마찬가지로 모래시계모양처럼 끌린건지,  3번은 세로선이 나온건지 설명해주시면 감사하겠습니다.  
회원작성글 희망생  |  2020.11.02
Q. RNA 260/230값이 한 sample 만 낮습니다.
안녕하세요? 저는 kidney tissue를 QIAGEN RNeasy kit를 사용하여 뽑는데요, 늘 260/230 값이 ~2.20으로 나왔었는데, 오늘 뽑은 4개의 sample 중 하나가 0.84로 엄청 낮게 나왔습니다... 중요한 sample 이었는데요 ㅠㅠ 제 생각에 4가지 sample 모두 동일하게 진행한 것 같은데.. 과정상의 문제일까요? 아니면 조직 자체의 상태가 안좋아서 그럴수도 있을까요? 저희는 조직을 RNA later 에 넣어 보관 후 뽑습니다! 과정상의 문제라면 어떤것을 주의해야 할까요? 감사합니다 ㅠㅠ
회원작성글 써니22  |  2020.10.29
Q. 흡광도 측정 결과
nano drop이라는 기계를 이용해서 RNA의 흡광도를 측정했는데 260/280 ratio 값이 2.3 나왔고 260/230 ratio 는 2.2이 나왔는데 이게 왜 좋은 수치인건가요??? 조교님이 이정도 나왔으면 믿을 수 있는 RNA라고 하는데 기준이 무엇인가요??  
회원작성글 나의라임오렌지나무  |  2020.10.23
Q. RNA extraction 후 freezing 필요여부
안녕하세요 HaCaT cell에서 Nucleozol을 이용해 RNA를 추출하여 RT-PCR 진행 중입니다 실험실 선배들 프로토콜대로 RNA extraction 및 isolation을 하는 초기 단계인데,  Nucleozol(또는 Trizol)로 RNA를 뽑아낸 뒤 최소 12시간 동안 -70도 조건에서 freezing을 해야 한다고 배웠거든요 그런데 뽑아낸 뒤 냉동 단계없이 바로 얼음에 박아둔 상태로 isolation으로 넘어가도 괜찮나요? 검색을 해보니 RNase 불활성화를 위해 한번 냉동하는 게 좋다는 것도 봤는데 정보가 많지 않아 질문드립니다.
회원작성글 아기고양이  |  2020.10.22
Q. RNA ethanol washing 후 drying
안녕하세요, 대학원 신입생입니다. ethanol washing 후 어떻게 하면 잘 drying을 할 수 있을까 고민중입니다. 제가 원래 쓰는 protocol은 이렇습니다.  1. 1.5mL E-tube에 담긴 RNA를 75% ethanol (1mL)에 washing (vortexing)하고 7500g / 4c / 7min centrifugation을 돌림 2. 상등액을 따라버리고, E-tube 뒤집어서 10~15분간 drying. 남아 있는 ethanol은 pipette tip으로 조심스럽게 제거. 문제는 상등액(ethanol)을 제거할 때, 가끔 상등액이 tube 밑 부분에 붙어있어서 잘 건조되지 않습니다. 15분을 건조시켜도 없어지지 않아서 pipette tip/syringe tip으로 밑에 붙은 상등액을 조심스럽게 제거했는데, RNA pellet가 이미 녹았거나, 건드렸거나 아님 오염됐는지 conc./purity가 잘 안나오더군요.  저희는 DEPC water로 RNA를 녹이는데, ethanol이 purity를 떨어뜨려서 상등액을 최대한 제거하는 방법으로 하고 있습니다. 정말 purity에 큰 영향을 미치나요? 어떻게 하면 잘 건조시킬 수 있을까요? 선배님들 조언 부탁드립니다. 감사합니다!
회원작성글 wassupyall  |  2020.10.18
Q. rna 가 너무 안뽑히는데 왜그럴까요ㅠㅠ
원래 농도가 1000-1200ng/ul 는 항상 나왔는데요 순도가 안좋더라도요   근데 6개월 후에 실험 다시 하는데 그때 부터 결과가 너무 안나와요 농도도  500-800 ng/ul 로 나오고 순도도 260/280은 잘맞는데 260/230 이 1.4-1.8로 나옵니다 ㅠ 저희는 2.0-2.2 사이로 사용하거든요 대체 뭐가 문제일까요 ㅠ 상층액도 잘딴다고 생각하거든요 마지막에 알콜로 넣고나서 건조 2-3h후에 rnase free water 30ul 넣고 나노드롭 으로 측정합니다....   알콜 건조시킬때 흄후드에서 안하고 지금 고장나서 이동식 후드 틀어놓고 건조시키는데 그거때문인지 ㅠ
회원작성글 좀잘하자아  |  2020.10.14
Q. RNA 추출시 RNA degradation이 일어나는 문제가 있습니다. 첨부파일
안녕하세요, RNA 추출을 하고있는 대학원생입니다. An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development 라는 논문의 protocol에 따라 Isopropanol+LiCl의 방식으로 회색곰팡이를 접종한 딸기에서 RNA를 추출하고 있습니다. 그런데 이제 RNA가 뽑히긴 하는데 자꾸 분해되어 뽑혀서 RNAse activity를 최소화하기 위해서 구매한 시약 제외하고 제가 만든 용액(CTAB extraction buffer, 3M NaOAc, 10M LiCl, 70% EtOH 제조시에는 멸균수 이용)을 모두 autoclave하고 저온에서 활성이 낮다 하여 처음 lysis과정을 제외하고는 모두 ice위에서 하고 4도에서 centrifuge했습니다. 그렇게 했는데도 RNA가 분해되어서 혹시 다른 의심되는 개선할만한 과정이 있는지, 아니면 sample의 상태를 의심하고 새로운 sample로 다시 해보는 게 맞는지 조언 부탁드립니다. 감사합니다. 
회원작성글 닉네임0115  |  2020.09.18
Q. Oxidated RNA 에탄올 침전 하면 pellet이 안녹아요
안녕하세요! Sodium m periodate로 RNA의 3'end를 oxidation 시켜주어 aldehyde기 를 만들어주었습니다. 이후 100% EtoH, NaOAc, glycogen을 처리하여 에탄올침전을 시켜주었는데 만들어진 RNA pellet이 어떠한 resuspension buffer(DEPC DW, NaOAc)에 녹지를 않습니다... 어디서 문제가 생긴걸까요?? 답변 부탁드립니다!!
회원작성글 넘어려워요ㅜㅜ  |  2020.09.15
Q. rna 순도 1.8-2.2 사이면 잘 나온건가요..?
선배님 한테 배우기론 2.0-2.2 사이를 사용하라고 하셨는데 제가 뽑은건 1.9-2.1 나 1.9.2.2 가 젤 많았어요  간혹 1.8도 있었구요 브릭에 쳐보니 1.8-2.2 까지 다양하게 괜찮다고 하시긴 하시던데   그리고 2.211 처럼 2.2 약간 넘어도 사용해도 될런지요 ㅠㅠ 실험이 쉽지가 않네요
회원작성글 좀잘하자아  |  2020.09.10
Q. Rna 추출 마지막 단계에서 시약을 많이 넣었는데
마지막 단계에서 추출한 rna에 rnase free water 를 30ul 넣어야하는데 모르고 훨씬 많이 넣었어요 나노드롭 했을때 결과는 잘나오긴 하던데 그대로 써도될까요?
회원작성글 좀잘하자아  |  2020.09.08
Q. RNA 추출 결과인데 추출이 잘 안된 것일까요? 첨부파일
안녕하세요, CTAB 방식으로 RNA 추출을 하고 있는 대학원생입니다. RNA를 추출하고 nanodrop으로 찍어보았는데요, RNA를 뽑았는데, 260/230의 값이 지나치게 낮고 전기영동시 밴드가 거의 보이지 않습니다(자세히 보면 겨우 2band가 보일 정도입니다) 이 정도 결과면 RNA가 잘 뽑히지 않아서 그런지, 단순히 깨끗하지 않아 clean up을 해주면 해결되는 문제인지 모르겠어서 질문드립니다. (혹시 clean up이 필요하다면 정확한 방법도 알려주시면 감사하겠습니다. 구글에는 다양한 방법이 있더군요...) 감사합니다.  
회원작성글 닉네임0115  |  2020.09.05
Q. RNA pull down assay VS RNA immunoprecipitation (RIP)
RNA pull down assay 와 RNA immunoprecipitation은 다른 실험인가요??ㅠ
회원작성글 넘어려워요ㅜㅜ  |  2020.08.27
Q. RNA 전기영동 결과좀 봐주세요 ㅠㅠ 첨부파일
2줄 떠야되는 거로 알고있는데 ㅠㅠ 2,6번 라인은 아주 안나왔고 나머지는 진하게 보이는건 3줄이 나와버렸네요  혹시 왜 이런 결과가 나왔는지 알수있을까요? ㅠ
회원작성글 팔탄농부  |  2020.08.27
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