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Q. RNA extraction 중 isopropanol 방치
안녕하세요 학교 실험실을 다니면서 실험을 배우고 있는 학부생입니다! 제가 RNA 뽑던 중에 isopropanol을 1시간 30분 정도 방치를 하고 centrifuge를 돌렸어야했는데 방치를 안하고 바로 centrifuge를 돌려버렸어요ㅠㅠㅠ RNA 뽑는데 많은 영향을 줄까요...?
회원작성글 우당탕탕  |  03.17
Q. DNA추출 마지막 단계에서 진공건조기가 없는데 어쩌죠...
PCR 시도해보려고 열심히 자료 조사하고 실험계획 만들었는데 슬프네요 다른 방법없을까요??   그리고 진공건조는 몇도에서 하는건가요??
회원작성글 Seoki  |  03.11
Q. 토양 DNA extraction 을 Rapid법으로 진행중인데 헤깔려서요.
DNA 농축 단계에서 이상한 점이 있어서요   1.5ml microtube에 옮긴 다음 10M NH4OAc 190um 첨가후 deepfreezer 10분 15000rpm 15분 상등액 2배 ethanol과 동일부피 iso-propanol 첨가하고 deepfreezer 30분 방치 상등액 제거, 70%ethanol 첨가하여 진공건조   단계에서 다르 부분은 ethanol 사용할떄 70%라고 정확하게 명시되어있는데 빨간색 쳐진부분은 etanol 농도가 안나와있더라구요 다른 논문을 찾아봐도 비슷하구.. 99%를 쓰는건지 70%를 쓰는지 궁금해서요.. 저희 실험실에 95% 밖에 없는데 이거 써도 괜찮은가요?
회원작성글 Seoki  |  03.11
Q. RNA 전기영동 결과 확인 부탁드립니다
RNA를 뽑았는데 예전에 해봤을때 농도가 90 ug이었는데, 이번에는 농도가 900 ug나왔드라구요.. 전기영동도 예전에는 28s 18s 5s 밴드가 잘 나왔는데 이번에는 잘못 뽑은걸까요.. 끌린 자국 속 진하게 보이는 두 밴드를 28s 18s라 추정하고 있는데 1. 나머지 희미한 밴드들은 뭔가요? 2. RNA를 다시 뽑아야 할까요? 답변 부탁드립니다
회원작성글 앨  |  03.10
Q. cDNA 합성 질문있습니다.
cDNA 합성하는데 Invitrogen SuperScript™ III First-Strand Synthesis System 제품을 사용하고 있습니다. 그런데 qPCR을 워낙 자주 하는지라 시약이 감당이 안되는데 혹시 volume을 낮춰서 진행(총 20ul라고 하면 10ul정도)을 하더라도 cDNA가 합성이 잘 될까요? 직접 test하기에는 또 시약이 들어가야 하니 엄두는 안나고 경험자 분들의 조언이 필요합니다.
회원작성글 왕초보석사생  |  03.10
Q. RNA isolation 결과 및 cDNA 확인하는 법 공유 부탁드립니다...!
RT-PCR을 진행하기 위해서   1. RNA isolation 2. cDNA 합성 3. PCR   해당 단계를 거치고 있는데, 2개의 어려움이 있어 글 올립니다...ㅜ     1) 아래 그림은 기존에 선생님과 진행하였던 RNA isolation과, 이번에 제가 직접 뽑은 RNA의 전기영동 및 농도를 비교한 사진인데, 제가 뽑은 RNA는 농도가 기존보다 10배 높고, 밴드도 전과 다르게 나왔습니다. (Q)왜 이런건지, 또 해결방안은 무엇이 있을까요?     2) 해당 그림은 RNA로 cDNA 합성 후, cDNA를 확인하는 방법이 있나요? e.g. 전기영동, nano drop 등..  
회원작성글 앨  |  03.08
Q. RNA 추출
안녕하세요, rna extraction 실험을 진행하고있는 학생입니다. 추출방법은 magnetic bead방식인데, 추출 후 농도를 측정하면 농도는 40-60 ng/ul 이고, 순도는 1.9-2.0 (260/280) 사이로 나오는데 증폭을 하지 않습니다.... 추출이 되고있지 않다고 생각 하고 있는데... 뭐가 문제일까요 도와주세요 감사합니다.  
회원작성글 초코맛꿀  |  03.04
Q. RNase Zap 사용 후 paper towel 사용에 관해 질문드립니다
RNA 관련 실험할 때 RNase 제거하기 위해 RNaseZap을 쓰시잖아요. 근데 제조사 설명에 따르면 RNaseZap을 사용하고 RNase-free water로 rinse 한 뒤, clean paper towel로 dry하라고 적혀있는데 깨끗한 일반 paper towel을 써도 상관이 없는 건가요? 구글 서치해봐도 다들 그냥 clean paper towel이라고만 적혀 있어서, RNaseZap으로 RNase 제거하고 실험실에서 쓰는 일반 paper towel을 사용함으로 인해서 다시 RNase에 오염되는게 아닌지 궁금해서 여쭤봅니다. 답변 미리 감사드립니다!
회원작성글 지겹당  |  02.28
Q. RNA 전기영동 조언부탁드립니다.
안녕하세요, 선배님들의 조언을 구하고자 이렇게 글을 올립니다. Trizol로 균주에서 total RNA를 추출하였고, 모든 실험과정에서 DEPC-treated water 및 DNAse/RNase free 제품을 사용하였습니다 (팁, 튜브 등). 추출 후 전기영동으로 quality를 확인하고자 진행하였습니다. 전기영동은 Qiagen 社에서 제공하는 방법대로 진행하였습니다.   1) Gel preparation (1.2% FA gel)   - 1.2 g agarose     - 10 ml 10x FA gel buffer (see composition below) Add RNase-free water to 100 ml. Heat the mixture to melt agarose. Cool to 65°C in a water bath. Add 1.8 ml of 37% (12.3 M) formaldehyde and 1 µl of a 10 mg/ml ethidium bromide stock solution.  2) 10X FA gel buffer  - 200 mM 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid (MOPS) (free acid) - 50 nM sodium acetate - 10 nM EDTA    pH to 7.0 with NaOH  3) 1x FA gel running buffer - 100 ml 10x FA gel buffer - 20 ml 37% (12.3 M) formaldehyde - 880 ml RNase-free water    Loading dye는 Invitrogen에서 판매중인 제품(#AM8552)을 구입하여 메뉴얼대로 진행하였습니다 (샘플1:dye3).  샘플은 1ug/ul로 희석 후, Sample 2ug (2ul) + loading dye (6ul) -> denature (65℃, 15 min) and cooling 후 1.2% FA gel에 loading 하였습니다.  전기영동 버퍼는 1X FA gel running bufer 사용하였습니다.   Nano-drop 정량 및 순도는 하기와 같습니다. 샘플 1: 4380 ng/ul, 1.9, 2.1 샘플 2: 4596 ng/ul, 2.0, 1.7   예전에 한참 RNA로 실험할때는, 추출 후 바로 cDNA 합성하여 PCR한 뒤 전기영동으로 확인하였었습니다. 부끄럽게도 total RNA 만을 전기영동 해본적은 없는데, 이번에 추출하면서 intact하게 추출되었는지 알 고 싶어 진행하는데 잘 되지가 않네요.   전기영동 탱크또한 DEPC treated water로 잘 닦고 건조하여 1X FA running buffer 사용하여 진행하였고, 버퍼도 당일 제조하여 새로이 사용하였습니다.   샘플은 농도 200ng으로도 진행해보았었으나 아예 보이지 않았습니다. (사진미첨부) 1ug으로 샘플 2개 (100V, 40min) 걸어보았지만 여전히 흐릿하였습니다. 2ug으로 샘플 1개 (100V, 40min) 걸어보았고, 결과는 비슷했습니다. 마지막으로는 전기영동을 러닝 시간을 줄여서도 진행해보았습니다 (샘플 2ug, 100V-20 min). 이렇게 했을 때 그나마 보이긴 했는데, 너무 명확하지가 않습니다.     조언을 남겨주시면 귀담아듣고 그에 따라 진행해보겠습니다.  total RNA 상태를 보려고 하는데 안되니까 너무 답답하고 오기가 생기네요! 미리 감사의 인사를 드립니다. 감사합니다.        
회원작성글 YuYu  |  02.24
Q. RNA 추출 퀄리티 봐주세요
Qiagen Qiaamp Viral RNA kit(column type)로 RNA 추출 후 농도측정 Con : 73.0ng/ul 260/280 : 2.92 260/230 : 2.60   중국 Virus RNA kit(column type)로 RNA 추출 후 농도측정 Con : 112.2ng/ul 260/280 : 3.21 260/230 : 1.88   kit protocol 그대로 수행했습니다. vortexing(15sec) step 있었습니다.   nanodrop 장비의 문제 일수도 있나요?
회원작성글 끄아앙  |  02.24
Q. RNA extraction 중 RNA가 사라지는 문제에 대해 질문드립니다.
Cell에서 Trizol assay를 통해 RNA purfication을 진행하고 있습니다. 간혹, iso-propanol 처리 이후에 75% etoh wash 후 센트리에서 꺼내보면 pellet이 사라지는 경우가 있는데 원인이 있는지 궁금합니다.... 처음엔 RNase contamination을 의심했는데 실험 중 RNase가 들어갈만한 일도 전혀없었고, 찾아보니 etoh의 농도가 70%보다 낮을 경우 RNA가 녹을 수도 있다는 글을 봤는데 실험엔 75% etoh를 사용했으니 이 이유도 아니라고 생각됩니다.... 도저히 답이 안나와 혹시나 다른 분들 중에 실험하시다 비슷한 경우가 있으셨는지, 원인은 찾으셨는지 여쭤보고 싶습니다,..
회원작성글 1q3e5t7u!  |  02.24
Q. 조직 유제 후 상층액에서 RNA extraction 관련 질문입니다.
안녕하세요, 현재 폐 조직을 유제한 뒤 나온 상층액에서 cytokine을 측정하려 하고 있습니다.   TRIzol reagent을 이용해서 total RNA를 추출한 다음 cytokine mRNA를 정량하려고 하는데,  프로토콜 상에서 cell suspension에서 RNA를 추출하려면 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 남은 pellet에 trizol을 넣으라고 되어있습니다. 그런데 저는 유제 후 조직 pellet을 버린 상층액만 남아 있어서(다른 실험에서 이용한 샘플을 다른 실험에 재이용하는 중이라 상층액만 남았습니다 ㅠㅠ) 원심분리를 해도 더 이상 cell pellet이 나오지 않을 것 같은데요   혹시 이런 경우 1) 어느 정도 양의 상층액에 TRIzol을 얼마나 넣어야 하는지 (프로토콜 상에서는 250ul의 배양액을 원심분리한 뒤 나온 pellet에 TRIzol 750ul을 넣으라고 나와 있었습니다.) 2) 상층액에서 RNA를 추출한다고 해도 농도가 매우 낮아서 yield가 낮게 나올 것 같은데.. 이런 경우 어떻게 해야 할지.. 3) 조직 유제 후 상층액에서 cytokine을 측정해 본 경험이 있으신 분이 있다면 주실 팁이 있으신지 알고 싶습니다. 답변해주시면 정말 감사드리겠습니다.  
회원작성글 대학원새싹  |  02.17
Q. qPCR 상대정량 질문이요....!
어떤 물질을 처리하고 day별로 mRNA 발현량을 보고 있습니다. 상대정량 ddCt로 day 0일부터 2,4,6일차까지 보는데 물질을 처리해야 발현이 나오는거라 day 0 (control) 에는 아예 Ct값이 뜨지 않는 유전자들이 있습니다..   원래 day 0와 비교해서 ddCt값을 계산하려고 했는데 day 0에 Ct가 뜨지않으면 값을 어떻게 계산해야할까요?ㅠㅠ day0은 negative로 두고 day 1과 나머지 day2,4,6을 비교하는 방법밖에 없는건가요?   답변 주시면 감사하겠습니다...!!  
회원작성글 GE  |  02.16
Q. DNA/RNA hybrid 구조를 RNA isolation(Trizol, chloroform 사용) 하면...
안녕하세요, 석사 재학중인 학생입니다. 현재 진행 중인 실험에서 궁금한 점이 있어서 질문드립니다! DNA/RNA hybrid 구조를 RNA isolation(Trizol, chloroform 사용) 하면 annealing되어있던 DNA를 걸러내어 RNA만 남길 수 있을까요?  (hybrid 는 대략 40bp 정도길이입니다)  
회원작성글 깐깐징어  |  02.16
Q. TR추출 후 RNA농도가 cDNA합성에 비례하는지 궁금합니다..
안녕하세요 RNA추출 후 RNA농도를 nano drop으로 측정을 하는데 궁금한 점이 생겨서 질문드립니다.. 제가 세포를 seeding하고 trizol로 TR을 뽑았는데 세포가 충분히 많이 seeding된 것을 확인 후 TR추출 후 농도를 측정하니 샘플 모두 대략 20-30ng/ul로 측정되었습니다. 그 후 cDNA합성 결과도 좋았고요 두번째로 seeding했을 때 제 실수로 세포가 엄청 작은 양이 seeding됐고 TR추출 후 농도를 측정하니 샘플 대부분이 대략 60-90ng/ul로 측정 됐고 제일 높은 샘플은 140ng/ul로 측정되었습니다. 그 후 cDNA합성 결과는 실패했습니다. 두번째 실험에서 세포가 원래 seeding되어야하는 1*10-4=1ml보다 확연히 작은 양의 세포가 깔렸는데 왜 RNA추출 후 농도는 더 높게 나왔는지 이해가 안됩니다. 첫번째 두번째 실험한 RNA의 흡광도 값을 봤을 때 순도의 문제는 없어보입니다. 이때까지 실험 했을 때 농도가 높은 샘플이 낮은 샘플보다 cDNA합성이 안된 경우가 많아 농도보다 RNA의 질적인 degradation이 되지않는게 중요하다고 생각해왔습니다.. 원리상 RNA농도가 cDNA 합성양에 비례하는 것인가요..? 두번째 실험에서의 세포양이 확실히 적었는데 농도는 더 높게 측정된 것이 이해가 안갑니다..ㅠㅜㅠ 
회원작성글 Want mRNA  |  02.15
Q. siRNA Santa transfection이 잘 안됩니다. 도움을 요청드립니다 (Protocol첨부) 첨부파일
안녕하세요. 최근 siRNA실험을 진행하고 있는 대학원생입니다.   siRNA 프로토콜을 열심히 숙지하고, siRNA에 대해서 공부하면서 처음으로 siRNA실험을 진행하고 있습니다만, Transfection이 잘 안되고 있습니다.   실험 초반, Gene Down이 된 것을 확인하고, 이 후 실험에서는 계속 Gene Down이 잘 되지않아 처음에는 siRNA의 실험을 자주하면서 활성도가 떨어졌을거라 가정도 했지만 제 실험방법에 문제가 있을 것 같다고도 생각하면서 브릭에 계신 연구원 선생님들의 지혜를 꼭 구하고 싶어서 이렇게 글을 씁니다. 내용이 길고 복잡하더라도, 도움주시면 저도 꼭 훌륭한 연구자가 돼서 많은 도움을 줄 수 있는 선배 연구자가 되겠습니다.   제가 사용하는 siRNA Protocol 입니다.  siRNA Protocol내용 중 1.Prepare the following solutions: Solution A: For each transfection, dilute 2-8 µl of siRNA duplex (i.e. 0.25-1 µg or 20-80 pmols siRNA) into 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868. 항목을 수행하기 위해   Target Gene에 대한 siRNA 시약(siRNA duplex)을 구매했고, Data sheet에 나와있는 Resuspension을 참고하여 [Resuspend lyophilized siRNA duplex in 330 µl of the RNAse-free water provided. Resuspension of the siRNA duplex in 330 µl of RNAse-free water makes a 10 µM solution in a 10 µM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA buffered solution] <- (Target siRNA Data sheet내용) 설명서대로 구매한 Target siRNA 파우더에 함께 제공된 RNAse-free water 330 µl를 넣었습니다. 그 후, siRNA Protocol을 참고하여 위에서 만든, siRNA duplex 8 µl를 따서 siRNA Transfection Medium: sc-36868 100 µl에 섞었습니다.   2.Solution B: For each transfection, dilute 2-8 µl of siRNA Transfection Reagent: sc-29528 into 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868. Peak activity should be at about 6 µl siRNA Transfection Reagent. 항목을 수행하기 위해 siRNA Transfection Reagent: sc-29528를 구매하여 100 µl siRNA Transfection Medium: sc-36868에 8 µl를 따서 섞었습니다.   3. Add the siRNA duplex solution (Solution A) directly to the dilute Transfection Reagent (Solution B) using a pipette. Mix gently by pipetting the solution up and down and incubate the mixture 15-45 minutes at room temperature. 3번 항목을 수행하기 위해   1번과 2번에서 만든 시약을 섞고 30분동안 상온에서 반응했습니다.   혹 제가 놓치고 있는 부분이나  잘못된 방법이 있다면, 선생님들의 지혜를 구하고 싶습니다. 다른분들도 도움이 될 수 있기에 글 삭제 안하겠습니다!   siRNA_Protocol도 첨부하였습니다.  
회원작성글 꿈많은청년  |  02.14
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