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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. western blot sds page에서 dw
western blot sds page를 만들 때 dw를 넣는걸로 알고있는데 dw의 정확한 역할이 무엇인지 잘 나오지 않아 sds page에서 dw를 넣어주는 정확한 이유를 알고싶습니다.
회원작성글 장추벌레  |  05.25
Q. Western 할 때 transfer
Transfer 8% gel에 100v 1h 30m정도 돌렸는데 Membrane에 아무것도 transfer가 되지 않았고 담겨있는 통도 뜨겁지않았습니다,, 기계문제일까요..? 예전엔 이렇게 해도 transfer가 잘 되었었는데ㅜ 무슨문제일까요..?ㅜ
회원작성글 뜌류링  |  05.25
Q. Western blotting 전 단백질 정량
Western blotting 하기전에 단백질 정량 안하는 경우도 있나요?
회원작성글 Luminous  |  05.24
Q. western blot transfer
western 고수님들,, 도와주세요 ㅠ western transfer를 하는데 어떨때는 잘 넘어가고, 어떨때는 우글우글한 밴드모양으로 잡히네요 ㅠ 이런식으로 밴드가 우글우글한데,, 검색해봐도 이런상황에 대한 trouble shooting이 잘 없네요ㅠ   transfer 방법은 100v 2hr(target protein이 큰게 있어서, 180kDa) tank로 진행합니다. transfer buffer는 10X transfer buffer(0.25M Tris, 1.92M Glycine,without SDS/1L) methanol 3L DDW 6L로 배합해서 사용합니다.  
회원작성글 rlaeheod  |  05.24
Q. western blot (WB) 웨스턴 블랏 샘플링 질문입니다
western blot 샘플을 만드는 과정과 관련하여 질문이 있습니다.    첫째날) 60mm에 cell seeding  둘째날) PBS wash 하여 상층액은 pellet down 하고 60mm plate는 -80도 냉장고에 얼린 뒤  셋째날) 해당 샘플을 lysis 한 뒤 단백질 정량하여 WB assay 용으로 만듭니다.    그런데 혹시 둘째날 단계에서 -80도 냉장고에서 얼리지 않고 60mm dish를 바로 lysis 단계로 가도 될까요? 
회원작성글 dingdongda..  |  05.23
Q. western buffer 조성 TBST
TBS 20x (concentrated TBS) 96.8 g Tris basel (400mM) 350.64 g NaCl(3M) Mix in 1600 ml ultra pure water. pH to 7.6 with pure HCl. Top up to 2 L. TBST For 1 L: 100 ml of TBS 10x + 900 ml ultra pure water + 1ml Tween20, 10X TBS를 만든다. 그것을 사용할 때마다 1x TBS로 만드시면서 tween-20을 원하시는 %에 맞춰 넣어주면 된다. Transfer buffer 10x 60.6 g Tris basel(250mM) 288 g Glycine(1.92mM) Mix in 2000 ml ultra pure water. pH to 8.3 with pure HCl. Top up to 2 L.   제가 이런저런 프로토골 보고 했는데 조성이 맞나요????
회원작성글 chobo lab  |  05.23
Q. western blot antibody
학교에서 알츠하이머 관련 실험을 하는데   western blot이용해서 실험을 진행합니다.   여기서 궁금증은 저희가 알츠하이머가 인산화된 단백질에 의해 발병된다 라는 가설을 가지고 실험을 진행하는데   antibody가 인산화 된 단백질을 targeting 하는 방법(원리)를 모르겠습니다.   아시는분은 많은 의견 남겨주세요.
회원작성글 아아아아아우  |  05.23
Q. IP 진행 후 western blot을 하였을 때 나타나는 IP sample과 input sample의 band 높이 차이
안녕하세요, 이번에 IP를 setting하고 있는 대학원생입니다. 이번에 직접 BF를 만들어서 WB으로 결과를 확인하였는데요, IP와 input의 band 높이가 달라서 이런 현상에 대해 문의를 드리고자 질문을 남깁니다. WB 상태도 썩 좋지는 않지만 ㅜㅜ, 그 부분을 제하고 봤을 때에도 band 높이 차이가 나는 게 이해가 잘 되지 않아서요. ----------------------------------------------------------------------------------- -같은 membrane에서 각각 다른 antibody로 detection한 결과입니다. -IP는 첫번째 사진의 antibody와 동일한 것으로 진행하였습니다. -이전 WB결과를 확인하였을 때, 첫번째(위) antibody는 50kDa에서 검출, 두번째(아래) antibody는 15kDa에서 검출되었습니다.   - IP lysis BF의 조성은 150mM NaCl, 50mM Tris (pH8.0), 1%NP-40, protease inhibitor, phosphatease inhibitor로 만들었습니다. - Beads는 Agarose resin(G)을 사용했습니다. - extraction은 1x sample BF를 80ul 넣어 95도에서 5분 끓이는 방법으로 진행하였습니다. ---------------------------------------------------------------------------------- 1. 단백질의 길이가 특정 과정을 거쳐 일부만 짧아질 수도 있는 것일까요? 2. 혹시 설마 하는 질문이지만 단백질이 짧을수록 IP를 진행했을 때 영향을 크게 받거나 검출이 어려울 수 있나요? 3. 추가적으로... BRIC을 통하여 WB이 세로로 끌리는 현상들은 BF의 pH의 문제 등이라는 것을 알 수있었으나, 가로로 넓어지는 현상 또한 이와 일맥상통한 문제일까요?   +) Heavy chain과 Light chain band 부분도 고려해 봤지만, 제가 알고있는size와는 달라서... western blot과 IP를 많이 경험해보신 선생님들께 조심스레 조언을 구해봅니다.
회원작성글 실험이버린손  |  05.22
Q. SDS-PAGE S-S bonding 원인 분석
안녕하세요 SDS-PAGE 관련 질문사항이 있습니다. 정제를 하던 중 Mass anlaysis 에서 항체의 intact form이 보이지 않고 여러 peak으로 보이길래 gel 을 내리게 되었습니다..   하나의 Band로 보여야할 샘플이 여러 band로 나뉘어졌음을 확인했습니다. (150 kDa 에서 하나로 보여야함) 그런데 더 신기한건 SE-HPLC 분석에선 여러 peak으로 보이지 않더군요.   항체 자체가 Low pH 에 sensitive한건가 싶은데 원인을 잘 모르겠습니다.. (Protein A 공정만 진행했으며 pH 3.5 로 elution 해서 그렇게 낮은 pH도 아니예요) 제가 아직 항체 구조에 대해 잘 모르는 상황이라 혹시 intact form 이 heavy chain, light chain, heavy-light chain 으로 쪼개질 수 있는 원인을 설명해주실 수 있는 분이 계실까요 ? (Enzyme, low pH, chemical 등등 관련 논문이라도..) 도움 주시면 정말 감사하겠습니다 ..
회원작성글 Cheli  |  05.21
Q. 그람음성균의 T3SS의 ExoT antibody 사용하시는 분이 계실까요?
안녕하세요. 제목과 같이 그람음성균의 Secretion system 중 type3를 통해 분비되는 ExotoxinT [ExoT]의 Antibody를 사용하시거나 구매를 하신 경험이 있다면 어디서 구매를 하셨는지 여쭤보고 싶어 글을 남기게 되었습니다.   또는 관련 정보를 아시는 부분이 있다면 알려주신다면 정말 감사드리겠습니다 ^^!  
회원작성글 도도형  |  05.20
Q. western blot 결과해석 해주세요ㅜ 첨부파일
2학년 학부생입니다. 웨스턴 블롯 첫 실험이라 결과 해석 자세하게 설명해주시면 감사하겠습니다. 
회원작성글 키키릴  |  05.19
Q. western blot 할 때, membrane washing을 왜 끊어서 시간을 재나요 (15 min, 4 times)? 그냥 1시간 full로 washing하면 안 되나요?
질문은 제목 그대로입니다. 15분을 4번 나눠서 shaker 위에서 washing 하는 것보다 1시간 연속으로 washing 하는 것이 끊김없어서 더 좋지 않나요? shaker 바로 앞에서 지켜보고 있어서 15분 알람이 울리면 바로 shaker 돌리거든요. 이렇게하면 1시간으로 시간 맞추고 shaking하면서 1X TBS-T로 membrane washing 하는 편이 더 효율적이지 않나 싶어서요. 몰라서 질문합니다.
회원작성글 퍼플로즈마리  |  05.17
Q. 생체 cell 전기영동 western 문제점 도와주세요ㅠㅠ 첨부파일
안녕하세요.. western 문제점에 빠져서 너무 답답해 글올려봅니다... 제가 mouse생체 NK cell을 샘플로 western하는 실험을 하게되었는데, 잘 나오던 결과가 어느 순간부터 밴드가 이상하게 뚫려서(?) 나오는 결과를 2주일째 보고있어요.. 여기저기 찾아봐도 찾질 못해서 글올려봅니다,,, 혹시 문제점을 알 수 있을까요..? 일단 mouse생체 NK를 뽑아서 하는 실험이라 결과가 잘나올것이라는 기대는 하지않았지만 처음에 잘나오다가 갑자기 6번째 분리들어간 샘플부터 이상하게 겔이 뚫린? 듯한 밴드를 보여서 문제점을 찾고자합니다. 볼트를 위아래로 조절도 해보았고, 겔농도도 조절해보았지만 저 현상은 여전히 나옵니다.. 여러항체를 써봤는데 b-actin 제외하고는 다 저렇게 나오네요.... 밴드가 검은색으로 보여야 정상인데 저렇게 뚫려서 결과가 나오는 이유를 알수 있을까요?
회원작성글 PHJ.  |  05.17
Q. western blot background
안녕하세요. western blot을 하는 와중에 membrane background가 엉망으로 찍혀서 band가 제대로 보이지 않은데  위 같은 사진들처럼 band가 명확하게 나오지 않고 수많은 점박이들과 같이 detection이 됩니다... troubleshooting을 하기 위해 원인을 찾아보고 있지만 background가 저렇게 되는 경우 해결방안에 대한 부분을 찾지 못해 도움을 구하고자 합니다..   현재 의심가는 부분은 1. 1차 항체 농도가 높아서 2. 2차 항체 문제로 발생 3. X-ray 필름 상태 문제 4. blocking 제대로 되지 않아서 등으로 생각하고 있는데  western blot을 4번째 시도하고 있지만 언제는 깔끔하게 나오고 언제는 저 사진들처럼 나와서 잘 나와도 제대로 된건지 의문이긴 합니다.. 도움을 주시면 감사하겠습니다ㅠㅠ
회원작성글 96호  |  05.16
Q. sample buffer, loading buffer
exosome을 lysis하여 WB하는 protocol에서 2x sample buffer를 넣고 그 다음 step에서 loading buffer를 넣으라는데 둘이 뭐가 다른건가요..? 저희 랩에서 cell lysis해서 sampling 할 때 lysis buffer와 5x sample buffer 넣기 때문에  5x를 2x로 희석하면 될 것 같은데 그 다음 step에서 loading buffer를 넣으라는데 이게 뭔지 모르겠네요ㅠㅠ
회원작성글 별헤는밥  |  05.16
Q. exosome lysis for WB
exosome을 lysis 해서 protein을 확인하려는데 protocol을 보니 그저 2x sample buffer를 이용하라고 되어있더라구요 혹시 저희 lab에 5x sample buffer가 있는데 DW로 dilution해서 2x sample buffer로 사용할 수 있나요? 그리고 protocol에서 loading buffer를 사용하라는 내용도 있는데 Running buffer를 사용해도 될까요?
회원작성글 별헤는밥  |  05.16
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