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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Plant Biology > Transformation
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Q. transformation
회사에서 가지고온 vector plasmid를 DH5α cp cell에 transformation 시켰는대요.colony하나를 100ml lb/ap broth에 seed해서 midi prep을 했어요.07% gel 걸어보니 밴드가 여러줄이 나와서 맞는 밴드를 gel extraction해서 이것을 다시 cp cell에 transformation 시켰는데 colony가 나오지 않았어요.왜 왜그럴까요 ㅠㅠㅠ gel extraction한 plasmid농도가 60ug/ml여서 100ul cp cell에 1ul 넣고 transformation해서 50배 희석해서 깔았는데 colony가 없어요 ㅠㅠ왜 그럴까요.... 
ㅇㅃㅊㅈㅇ  |  2012.04.04
Q. DNA purity 값?
transformation 을 하고 picking 해서 culture 를 한뒤mini-prep 을 하면 12개 에서 3개정도만 purity 가 좋습니다.왜그런지 도통 모르겠습니다.260/280 값은 1.8 - 2 사이로 적당한데260/230 값은 0.3-0.8 정도 밖에 안됩니다.vector 는 pET 28 a 라서 low copy 이긴한데 mini-prep kit 을 사용하는데 왜그럴까요? 왜 260/230 값이 저렇게 나오는지 궁금합니다.cutlure 상에 문제가 있는건가요?
회원작성글 yeast  |  2012.03.31
Q. tansformation 하고 배양했는데 사진좀 봐주세요.
cloning 실험을 한번도 안해보고 이번에 혼자 진행하고 있는데요(실험방에 해본사람이 없어요ㅠ)교수님께서 플라스미드 DNA를 주시고 이게 오래되었으니 transformation해서 한번 플라스미드를 뽑아보라고 하셨어요 그래서 제한효소 처리와 Ligation 안하고 그냥 플라스미드만 Competent cell에 transformation 하고 배양했습니다. transformation은 다음방법으로 진행했구요.non-heatshock transformation1. 얼음, 37℃ Plating Beads, selective plate를 준비한다.2. Competent cell을 흐르는 물이나 수조에서 1/3정도 녹인다.(약 10~20초 소요)3. DNA를 넣고 (cell 용량의 1/10미만) 1초간 vortex한다.4. 얼음에 1~10분간 방치한다. (6Kb보다 큰 Large plasmid의 경우 얼음위에서 20분 42℃에서 1분, 다시 얼음위에서 20분 방치한다.)5. 37℃로 예열한 seletion plate로 옮긴 후, plating beads를 이용하여 spreading한다.6. 즉시 37℃에서 배양후 colony를 관찰한다. (HIT-DH5a : 16-18시간)시간을 잘못계산해서 20시간가량 배양했는데 사진처럼 빼곡히 좁쌀 보다 작은 것이 플레이트를 뒤덮었습니다. 플레이트에서 냄새도 심하게 나는데 이거 잘못된거죠? 무엇이 문제일까요ㅠ
초보실험생  |  2012.03.23
Q. Cloning 당연한걸 묻는거 같긴한데요
cloning 실험을 하려고 하는데요. 이때 까지 한번도 해본적이 없어서요 플라스미드 DNA를 예전에 실험실에서 보관해뒀는데 deep freezer가 고장난적이 있었답니다.이게 되는 건지 교수님께서 실험해보라고 하셨어요.그런데 그냥 플라스미드 DNA만 가지고 LB배지에 배양한다고 해서 콜로니가 형성 되나요? 제생각으로는 이 DNA를 competent셀에 transformation한다음에배지에 배양해봐야할것 같은데 사실 이게 cell인지 추출한 DNA인지도 모르겠습니다.이게 DNA라고 가정하면 이것을 배지에 배양하기만해도 대장균이 자랄까요?
회원작성글 exon1223  |  2012.03.22
Q. Antibiotics : Blasticidin 써 보신분 조언 부탁드립니다.
안녕하세요,제가 갖고 있는 plasmid 에 selection marker가 Blasticidin 로 되어 있는데요,Maxi prep을 하려고 DH5alpha에 transformation 하여 LB agar plate에 colony를 띄우고 있습니다.저녁에 transformation 하고 다음날 확인하면 이상하게 E. coli가 구름처럼 뿌옇게 보입니다.Plasmid DNA를 넣지 않은 comp. cell(negative con.)과 함께 뿌옇게 E. coli가 자랐습니다.단지 plasmid DNA를 넣은 조건에 대해서는 colony 가 10개 남짓 생기긴 했습니다.사용하는 blasticidin은 invitrogen 사의 Blasticidin S HCl 이구요. 적정 농도가 50~100 ug/ml 이라 75 ug/ml로 LB agar plate를 만들었습니다.low salte의 medium을 사용해야 한다고하여 그대로 따라만들었습니다.Amplicillin이나 kanamycin 저항성 plasmid DNA는 문제 없이 얻어내고 있는데요.유독 blasticidin이 열에 약하다거나 salt 조건에 따른 용해도 등등의 사용상 특이점이 있는지 모르겠네요.BlASTICIDIN  사용해 보신 분들 조언 부탁드립니다. 제발요 ㅠㅠ 어떠한 내용이라도...
회원작성글 김기사  |  2012.03.12
Q. 클로닝이 2달째 안되고 있어요..
안녕하세요.1월 부터 지금까지 클로닝 중인데 안되고 있어서 이렇게 질문 올립니다.제가 하고자 하는 클로닝은 pcDNA4/HisMax에 His tagging된 680bp의 insert를 EcoR1으로 원컷하여 EcoR1으로 원컷한 5400bp의 다른 벡터로 옮기는 것입니다.일단 pcDNA4와 5400bp의 DNA를 DH5알파 컴셀에 Transformation해서 많은 콜로니가 떴구요.,그 중 잘 자란 몇 녀석을 서브컬쳐해서 quagen의 mini prep을 이용해서 plasmid를 추출해냈습니다.그 DNA에 EcoR1처리해서 agarose gel로 확인해보면 원하는 band만 확인되었구요.(pcDNA4와 잘린 insert, 5400bp의 다른 벡터)원하는 부분만 잘라서 intron의 mega sppin agarose gel exctraction으로 DNA 추출했습니다.(uv 켜놓고 잘랐으며 최소 노출되도록 노력했습니다.)이 녀석들을 T4 ligase로 붙였는데요(D.W 4 람다, 5X ligase buffer 4람다, restraiction된 5400bp의 벡터 1람다, ligase 1람다)+insert 10 람다의 조건으로 4'C O/N 했습니다.(위의 시약 조성은 다양하게 시도해봤으나 4'C O/N조건은 항시 유지했었습니다.)그러고 나서 DH5알파 컴셀에 TRANSFORMATION 하고 LB-AGAR PLATE에 도말하면 콜로니가 아예 안 뜨거나 적게(1~20개 내외)뜹니다.(transformation도 다양한 조건을 해봤습니다..ㅠ_ㅠ)이 콜로니를 다시 서브 컬쳐->mini prep->R/E->agarose gel 확인 하면 상항 싱글 라이게이션된 상태만 관찰됩니다. (insert는 없고 벡터만 있는 상태)실험실 사수 언니가 하고 있는 클로닝에서는 문제가 없는 것으로 보아시약 및 키트에는 문제가 없는 듯 합니다.주로 키트를 사용하다보니 딱히 어디에서 문제가 있을것같다고 콕 찝어 이야기 하기도 어렵습니다..브릭의 고수님들 도와주세요...ㅠㅠ
석사신입  |  2012.03.08
Q. ligation이 제대로 된 걸까요?
transformation이 너무 안되어서 ligation이 제대로 되는지 gel 을 통해서 확인해봤습니다.제대로 된것이 맞을 까요?
회원작성글 Mocha  |  2012.02.24
Q. Ligation 뭐가 문제일까요??
정말 cloning이 안되서 죽겠습니다.. ㅠ.ㅜ계속 해보다가 안되서 초심으로 돌아가 한 step씩 확인 하면서 진행하고 있습니다..현재 manual과 kit을 이용해서 진행을 하고 있는데요..우선 vector는 pET vector를 사용하고 있구요..(약 5.7kb) insert는 약 1000bp입니다..그림1. 은 manual로 vector와 inset를 enzyme cutting한 사진인데요..1, 2 lane product를 ratio 1:3으로 넣고 ligation을 했습니다. (4℃ overnight)그리고 gel을 내려봤는데.. 그림 2와 같은 결과가 나오네요..(그림 1. marker는 100bp, 그림 2. maker는 1kb)그림1.                          그림2.         뭐.. 이거 어떻게 해석을 해야하나요? vector끼리 ligation이라도 된건지... 혹시나 해서 transformation 했는데 colony는 하나두 안떳네요..그리고 kit을 사용하여 cloning한 사진입니다..그림3. maker다음에 cloning 원액이구요.. lane 2, 3은 1/5, 1/10 dilution 한 사진입니다..양이 많아서 그런가.. 원액은 6kb가 넘게 band가 뜨는데.. dilution한 band는 clonin이 안된 size로 보입니다.. transformation 결과는 colony는 이쁘게 잘 떳는데.. 모두 blue colony입니다..뭐가 문제인제 잘 모르겠네요.. band가 저렇게 뜨는것도 왜 그러는지 궁금하구요..조언해주실 분 안계실까요?? ㅠ.ㅜ
대학원생  |  2012.02.20
Q. Plasmid 추출 후 전기영동에 대해 질문드립니다. 첨부파일
안녕하세요. 생명공학과의 4학년에 재학중인 학생입니다제가 처음으로 예상 사이즈에 밴드가 나와 transformation까지 했는데요일단 enzyme cut 까지 결과는 잘 나왔습니다.제가 여쭤볼것은 ' plasmid 추출후, enzyme cut 전 '의 전기영동에서 밴드들이 궁금해서 질문 드렸습니다.일단 저의 insert DNA 크기는 998bp 이고벡터는 T-easy vector (3015bp)를 사용했습니다. 1. cuting 전에  전기영동을 하면 벡터와 insert DNA 결합한 밴드가 4000 부근에서 안나오고    2500 대에서 짙게 나오는지.2. 크게 3가지 밴드들을 linear 등등 구분을 하는데 각 이름과 특징들을   알려주시면 감사하겠습니다.전기영동 사진을 첨부파일로 올리겠습니다.마커(맨 왼쪽)는 1kb 이며 4개의 콜로니에서 채취했습니다.
학부생  |  2012.02.20
Q. transformation이 잘 안되는 것 같네요.
예전에 TA cloning이 잘 안돼어서 글을 올린적이 있는데희안하게 blunt end cloning은 잘 되어서 진행을 하였습니다.이번엔 여기서 insert를 꺼내어 발현 벡터에서 삽입을 시키는데 transformation이아예 안돼는 것 같습니다.발현벡터와 ligation 후 agarose gel을 통하여 ligation 된 것도 확인을 하였고,이를 DH5a에 T.F 하였는데.....colony가 하나도 생기지를 않네요...Vector + Insert size는 5Kb, 10kb 로 두가지 있습니다. ampicillin 내성이구요.T.F protocol은 ice 20 분, Heat shock 30초, ice 2분 후 S.O.C media 넣고 1시간 배양 후50ug/ml Amp plate에 spreading 하였습니다.Comp cell은 구매하여 사용하고 있구요, control에서는 잘 나옵니다.그래서 이번에는 electrocompetent cell을 사용해볼까 하는데 어떤게 좋을까요??
회원작성글 Mocha  |  2012.02.15
Q. homologous recombination 후 확인방법에 대해 문의드립니다
apramycin을 knock out 시키고자 하는 gene 사이에 넣고이를 cell에 transformation시켜 genomic DNA 상의 gene이 homologous recombination에 의해 자연적으로 knock out이 되도록 유도하였습니다실험결과 apramycin이 포함된 LB 배지에서 자란 colony를 따서PCR을 하였는데 결과는 knock out이 되지않은 gene의 size와 동일하였습니다homologous region은 앞뒤로 400/600bp 정도 이구요..이 homologous region이 genomic DNA상의 다른부분과 일치하여apramycin gene이 다른부분에 들어갔다고 생각하고있는데요..apramycin gene이 정확하게 들어갔는데도PCR결과가 이렇게 knock out 되지 않은 것처럼 나올 수도 있는건가요?혹시나 집고 넘어가지 못한 부분이 있나 생각되어 문의드립니다
회원작성글 별빛달빛  |  2012.02.10
Q. 실험 조언 부탁드립니다.
미생물에 막단백질을 knockout 시켰습니다.활성이 없어지는 것을 확인 하였습니다.이 유전자를 플라스미드에 넣어서 knockout 미생물에 transformation 하였고 발현되는 것을 확인 하였지만 활성은 다시 돌아오지 않습니다.어떻게 이해해야 할지를 모르겠습니다.조언 부탁드립니다.
작성자  |  2012.02.08
Q. cloning관련 질문 있습니다!!
인고의 세월 끝에 RACE를 끝마친 후 5` region과 3`region을 합쳐 Full-length cDNA sequence를 예상하였습니다. 5`-ATGTGGACCTCAGATGGACCTCATTCCCGATGGACCTCATTCCCGATGGACCGATGA-3` ATG와 stop codon인 TGA를 포함하여 primer를 제작하였고, 지금까지 cloning에 이용하였던 cDNA와 새로 합성한 따근따끈한 cDNA를 template로 하여 각각 RT-PCR을 수행하였습니다(같은 primer를 이용해서요).그런데 각각의 amplication product를 loading한 결과 size가 50~80bp정도 차이가 나길래 size별로 Gel elution을 하여 TA ---> E.coli transformation ----> Plasmid extraction ----> EcoRI treatment(이과정에서 역시 50~80bp정도 size의 차이가 보였습니다.)한 후 sequecing의뢰를 하였습니다. 오늘 결과가 나왔는데1. 5`-ATGTGGACCTCAGATGGACCTCATTCCCGATGGACCTCATTCCCGATGGACCGATGA-3`2. 5`-ATGTGGACCTCAGATGGACCT                               CATTCCCGATGGACCGATGA-3`      1번 : size가 컸던 product      2번 : size가 50~80bp정도 작았던 product 입니다. 5` region쪽에서 저러한 blank가 생겼다면 cDNA합성시 끝까지 달리지 못한 것으로 이해를 하겠지만 중간에 떡하니 blank가 자리잡고 있네요.. blank를 기준으로 5` and 3`쪽은 예상했던 sequence와 완전히 일치합니다. Full gene을 끄집어 내긴 했지만 저 blank가 생기는 이유가 너무 궁금해서 bric에 도움을 요청합니다. 참고로 위에 적은 서열은 임의적으로 작성한 것입니다.
하하호호  |  2012.02.08
Q. baculovirus system, Transformation step 에서의 질문이요.
저는 이번에 baculovirus expression system 을 구축하게된 신입석사생입니다.주위에 baculovirus system을 다루시는 분들이 계시지않아 discussion에 어려움이 있습니다. 도와주세요 ㅜ우선 저는 invitrogen사의 pFastBac HT vector를 이용하고 있습니다. 원하는 유전자를 클로닝하는 과정은 enzyme처리와 pcr을 통해 클로닝되었다고 확고히판단하여 MAX Efficiency® DH10Bac™ Competent E. coli 에 Transformation 단계를 실시하였습니다.(protocol그대로 수행하였습니다.)화이트/블루 콜로니 눈으로 선명히 구분할 수 있었으며 colony pcr을 수행. pUC/M13 primer를 이용해 Tn7 recombination 되었는지 확인하였습니다.control로 blue도 따서 확인했습니다.그런데... 이론상으로, Blue- 300bpWhite-  2.4kb + 1kb(gene of interst) = 3.4kb 가 나와야하는데 blue는 300bp에서는 뜹니다.그런데  한 4-50개  White colony를 확인한 결과 모두다 2.4kb에서 뜹니다.이는 insert가 안들어간 original vector가 recombination되었다는 결과인데.저는 분명히 클로닝된 clone을 넣었습니다. 저와같은 사례를 찾아보려했는데 그런사례는 찾아볼수없네요. 혹시나 제 클론이 self ligation vector와 섞여있을까 해서 cloning 되었다고 생각한 clone을 DH5a에 다시 transformation하여 5개 pick하여 enzyme처리 하였으나 self는 없었습니다.recombination되는 과정에서 insert가 떨어져 나가는 경우가 있는것인가요?어떠한 확인이 필요할까요? 제발도와주세요.ㅜㅜ
회원작성글 two0150  |  2012.02.05
Q. ligation 결과
저의가 ligation을 한후 com cell에 transformation 하고 그리고 colony 를 통해 결과를 봅니다.그런데요 ligation 을 transformation 하기 전에 전기영동으로 ligation 이 어느정도 잘 됬는지 확인하고 하면 안되나요?제가 듣기론 ligation 한 것은 전기 영동해도 잘 보이지 않는 다고 하더라고요.그 이유가 왜 그럴까요?제가 학부생2학년이고 실험실 들어온지 3개월 밖에 안되서 그런지  많은 지식이 부족합니다ㅠㅠ고수님들 알려주세요!
회원작성글 궁금합니다.  |  2012.02.03
Q. ligation 질문이요!!
어제 열심히 ligation을 하고, 확인을 위해서 전기영동을 하였는데요,,박사님께서 ligate는 전기영동을 하지 않고 바로 transformation해야 한다고혼을 내셨습니다 ㅠㅠ어차피 전기영동 해봐야 band가 안 나온다고요..왜 ligate는 band가 안나오는 것인가요???사이즈가 작아져서 인건지... 궁금합니다.
실험실첫등장  |  2012.02.02
Q. genomic DNA gel사진 좀 봐주세요!ㅠ 첨부파일
Yeast에 transformation을 해서 제대로 들어갔는지 확인하는 실험을 하고 있습니다.genomic DNA를 뽑아 gel을 걸어봤습니다.걸었을 떄 맨 위에 밴드가 나오길래 그거구나 싶어서 PCR을 진행했습니다.PCR 할 떄마다 아무것도 뜨지 않습니다.genomic DNA의 purity가 낮아 혹시나 하는 마음에gel extraction을 해서 PCR을 떠봐도 아무것도 나오지 않는 것은 같았습니다.gel extraction이 되지 않는 거 같습니다. control은 E.coli에 같은 plasmid를 넣은 것을 colony PCR로 했더니 이건 잘 나옵니다.PCR조건은 이상이 없다고 생각됩니다.gel사진을 보시고, 뭐가 이상한지, 어떻게 수정하면 될지 말씀해 주시면 고맙겠습니다.genomic DNA는 RBC kit로 진행하였고, 그 중에 RNase 처리는 additional step이어서 처리하지 않았습니다. 혹시 그 때문일까요?RNase가 실험실에 없으면 LiCl2로 침전시키는 방법도 있던데, 그 방법으로도 가능할까요?
초보초보  |  2012.02.01
Q. 전기영동, DNA 끌림현상이 일어납니다.ㅜㅜ 첨부파일
pcDNA3.1(zero)(5.0kb)와 582bp의 EPO gene을 ligation 한 뒤 DH5알파 C.cell에 transformation시켜 colony를 확인한 뒤 다시 항생제 있는 배지에 키워mini prep하여 size를 확인하기 위하여 enzyme으로 자른 뒤 (Nhe1) gel에 걸어보았는데요.보시다시피 DNA가 걸리지 않고 저렇게 끌리게 나왔습니다.ㅠㅠㅠ각 각 DNA농도는 나노 드랍으로 쟀을 때 259, 260 , 600 ng/마이크로 리터 정도 나왔습니다.ㅜㅜ왜 이런 현상이 나왔는지 ㅠㅠ의견을 구합니다.ㅜㅜㅜ5000과 6000size 중간 정도 쯤 나와야 하는데 ,,ligation은 시킨 뒤 transformation하기 전 에 gel에 걸어 확인 했을 때,insert의 양이 많긴 했지만 미약하게나마 band가 보였습니다. ㅠㅠ
회원작성글 석사1학기  |  2012.01.31
Q. homologous recombination 시 구체적인 protocol 이 궁금합니다
K. pneumoniae 관련 gene knockout을 위해 overlap PCR을 통해 homologous recombination 할 product는 이미 만들었구요이제  K. pneumoniae의 genomic DNA에 linear DNA를 homologous recombination 시키고자 합니다이 경우 transformation방법 중 heat shock으로 할 생각인데요K. penumoniae의 competent cell 100ul에 넣고자하는 linear DNA 10ul를 넣고ice에 20분, 42도 1.5분, 1~2시간 배양, spreading...위 방법으로 homologous recombination이 일어날 수 있나요?관련 protocol을 찾지못해 질문드립니다
회원작성글 별빛달빛  |  2012.01.25
Q. Agrobacterium 배양에 대해 질문합니다.
Agrobacterium 배양에 대해 질문드려요transformation을 위해 LB배지에 28도, 250rpm, 36시간 배양을 하는데요..배양이 되고나서 원심을 하면 계통에 따라 점성이 다르거나 약한것같아요그리고Agrobacterium을 배양할때 쓰는 액체배지는LB배지보다 YEP배지가 더 배양이 잘되나요?그리고 배양조건은 어떠한 조건이 적절한지좋은 답변 부탁드려요
회원작성글 보로봉봉  |  2012.01.13
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