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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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Q. 단백질 분석 외주
다양한 조건에서 단백질을 추출해서 함량을 비교해보고자 하는데요, 분석 외주를 맡기고자하는데 개인 수준에서 하려다보니 내용이 어려워서 잘 모르겠네요.. 복합 단백질인지 정제 단백질인지를 정확히 알아서 의뢰를 하는게 좋을 것 같은데, 대두 단백질처럼 추출하면 어떤 단백질일까요..??  
회원작성글 쥬해  |  2021.04.26
Q. 전기영동 electrolysis 실험 오류
전기 영동실험 결과인데,  restriction enzyme digest로 plasmid ligation process를 준비하는실험입니다. 이론상 lane2 3 4(pcr1 2 RE1)에 한개의 band만 생겨야되는데, 500~650 사이 band가 자꾸 생기는데 왜이러는걸까요? 사용한 restriction enzyme은 PCR product1&2에 붙지않는 enzyme인데 결과가 자꾸 이렇게나옵니다.. lane 2 3 4는 각각 PCR product1, PCR product2, PCR product 1&2가 들어있고 같은 restriction enzyme을 사용했습니다. 제생각에는 cDNA가 supercoiled 되는현상때문에 이렇게되는게 아닌가싶은데 원래 이정도로 band가 뚜렷하게 보이나요?
회원작성글 Heatko  |  2021.04.12
Q. human serum 농축 방법?
안녕하세요. 석사 1학기차 학생입니다. 사람 혈청을 이용하여 elisa를 하려고 하는데 target protein에 대한 민감도가 너무 낮아 한 번 농축을 시킨 후 elisa를 진행하고자 합니다. target protein의 크기는 25kDa입니다. 혈청을 농축시켜보신 분 있으신가요? 있으시다면 어떠한 방식으로 하셨나요? 검색을 하고 있는데 잘 안나오네요 ㅠㅠ
회원작성글 버들  |  2021.04.10
Q. media 얼리기
cell에 lactogenic hormone을 induction하여 media에서 protein발현을 확인하는 실험을 할 예정입니다.   media를 회수해서 elisa실험을 먼저 진행하고 동일한 media에서 protein을 추출해 western을 진행할 예정인데요! elisa진행할 동안 media를 -80도나 -20도에 얼려놨다가 녹여서 protein추출후에 western해도 되나요?   media 얼리고 해동후에 실험해본적이 없어서 protein에 영향을 줄까봐 걱정입니다..!
회원작성글 jchjhjhk  |  2021.04.06
Q. BCA 단백질 정량 계산.. 어떻게 하는 건가요??
이 이후에 x축에서 sample의 농도를 구하는 계산을 어떻게 하는 것인지 설명해주세요ㅜㅜ
회원작성글 dlwpRmxdls..  |  2021.04.05
Q. OD값에 따라 발현되는 단백질차이
똑같은 단백질을 발현하는데 저번에는 600nm에서 0.6을 맞추고 단백질 발현을 했습니다. 근데 이번에 거의 0.69까지 자라서 혹시 결과가 바뀔까요? 무슨 차이가 있을까요?
회원작성글 지니25  |  2021.03.26
Q. SDS-PAGE에서 SDS의 역할 질문입니다.
안녕하세요.  SDS-PAGE 실험을 진행하며 SDS의 역할에 대해 공부를 하는 도중,   SDS : 계면 활성제로써, 단백질들을 변성한다.  두개의 아미노산 당 비특이적으로 SDS 한 분자가 붙어 아미노산 R기 들의 전하를 모두 상쇄시킴.  -> 각 단백질들은 선형의 폴리펩티드로 변성된 후, 각 폴리펩티드의 길이에 비례해 음전하를 띤 상태가 된다.    화학 지식이 좀 부족한 터라 위에 밑줄 친 부분이 이해가 잘 안가는데요. .  조금더 상세히 설명해주시면 정말 감사하겠습니다 ㅜㅜ
회원작성글 행인2  |  2021.03.24
Q. Extraction of tissue RNA & Protein 전문 선생님들께,
과학기술분야에 종사하시는 선생님들께, 안녕하세요.  저는 이번에 과제연구원으로 새로 랩실을 꾸리고 있는 대학생입니다.  스스로 공부는 하고 있지만 모르는 부분이 많고, 새로 실험실을 거의 혼자 꾸미려다보니 막막하여 전문가분들께 의견을 여쭙고자 글을 적습니다.  저는 앞으로 실험실에서 C57BL/6 mice를 동물모델로 Tissue (Brain - Cortex, hippocampus, Kidney) 및 혈액 (Whole blood 또는 Serum, Buffy coat) qRT-PCR, ELISA, WB을 통한 생화학적 분석을 하려 합니다.  단도직입적으로, 선생님들께 여쭤보고 싶은 것은 'Extraction of tissue RNA & Protein' 부분입니다.  1. Tissue 에서 RNA 또는 Protein 을 추출하기 위해서는 조직을 파쇄하는 것이 더 효과적이라고 들었습니다. 저는 조직을 파쇄하는 방법으로 Syringe와 RIPA lysis buffer를 이용하는 방법, Bead와 PBS를 이용한 Homogenization 방법, 또는 PBS를 더한 후, Sonication 하는 방법이 있는 것으로 알고 있습니다. 실험실에서 실험방법을 재정립하는 과정에서 이 3가지 방법 중 또는 다른 방법 중 어떤 방법이 효과적일까요? 전문 선생님들께서 경제적인 측면도 고려해주셔서 의견주시면 감사하겠습니다..! 2. Tissue 파쇄 또는 균질화 후에 보관 방법은 어떻게 하시고 계신지요? (예. -20도 냉동고에서 일주일 보관, -80도 냉동고에서 1년 이상 보관) 3. Tissue 마다 RNA 또는 Protein 추출하는 방법이 다 다른가요? 아니면 동일한가요?  4. Tissue에서 Protein 추출 후에는 단백질 정량을 하려합니다. Bradford assay를 통해 정량하려하는데 괜찮을지요? 어떤 글에는 BCA assay로 보통한다는 글이 있어 여쭤봅니다.  5. 단백질 정량 후에는 ELISA, WB을 하려하는데, 실험 순서는 어떻게 진행하면 좋을지요?  구체적으로 설명해주시거나 상세히 도움주실 선생님들.. 쪽지나 답변 꼭 부탁드립니다..!  제 글 읽어주셔서 감사합니다.  실험 초보 좀 도와주십시오.
회원작성글 21cbnuEM  |  2021.03.23
Q. DMSO 제거
안녕하세요. 초보적인 질문 한가지 드리려 합니다. 현재 대략 15% DMSO에 녹아있는 Protein에서 DMSO를 제거하고 싶은데 lyophilize 는 너무 오래 걸릴 것 같아서 다른 방법을 생각 중인데 GPC로는 제거가 불가능 한가요? 아니면 다른 column을 이용해야 하나요? DMSO를 효율적으로 제거할 수 있는 방법 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 soh0915  |  2021.03.16
Q. nuclear extract 진행 후 western blot 혹은 NFkB p65 activation assay
안녕하세요 석사과정을 진행중인 학생입니다.   nuclear protein extract를 진행하여 NF-kB p65 activation assay 와 western blot을 진행하고자 합니다. 저희 연구실에서는 active motif에 nuclear extract kit (cat#40010)을 사용하고 있는데 마지막 단계까지 진행 후에 LSB (Laemmli sample buffer) 를 넣고  boiling 을 진행한 후 상층액을 통해 NF-kB p65 activation assay 와 western blot을 진행하면 되는것인지 질문드립니다. 혹은 LSB (Laemmli sample buffer)를 넣지않고 protocol 마지막 단계에서 단백질 정량 후 western blot 혹은 NF-kB p65 activation assay를 바로 진행하면 되는것인가요?   추가로  만약 LSB (Laemmli sample buffer)를 넣지않고 진행하는 것이 맞다면 active motif에 nuclear extract kit (cat#40010)가 아닌 NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction reagents (cat#78835)도 LSB (Laemmli sample buffer)를 넣지않고 단백질정량 후 바로 western blot 혹은 NF-kB p65 activation assay 를 진행하면 되는것인가요?     답변 부탁드립니다..
회원작성글 당나귀  |  2021.03.15
Q. 콜라겐 추출에 관하여...(엘피스, 안재진, 강시 선생님 살려주세요)
안녕하세요.   글을 자주 올리게 되네요. 선배님들의 조언이 실험을 하는데 많은 도움이 되어 자주 찾아뵙게 되는 것 같습니다.   오늘은 세가지 질문을 드리고 싶습니다.   1. 저는 펩신 가용화 콜라겐 추출 실험을 현재하고 있습니다. 0.5M acetic acid에 pepsin을 함께하여 교반 후 원심분리하여 얻은 상층액을 염침전시켜 투석을 하고 있습니다. 근데 아세트산을 투석외액으로 사용하기 이전에 Na2HPO4를 투석외액으로 먼저 사용하던데, 그 이유가 펩신을 불활성화 시키기 위함이라고 알게 되었습니다. 제가 알고 있는 것이 맞는지, 맞다면 간단하게 원리를 설명해주시면 감사할것 같습니다.   2. 1번에서 투석 및 동결건조까지하여 얻은 콜라겐을 물에 녹였는데 잘 녹지 않았습니다. 제가 샘플을 녹인 용액은 아세트산을 사용하였는데 아세트산에 녹여서 전기영동을 해야하는지, 아니면 에탄올이나 DMSO에 녹여서 전기영동에 사용하여야 하는지 궁금합니다.   3. sds page용 단백질 샘플을 만들 때 샘플버퍼를 넣고 폴리펩타이드를 선형으로 만들어주기 위해 95도에서 약 5분간 반응시키는걸로 알고 있습니다. 콜라겐은 열변성에 특히 취약해서 실험을 저온조건에서 진행해야하는데 그러면 95도 가열도 하면 안되는지 궁금합니다. 콜라겐 단백질 추출 및 전기영동을 해보신 선배님들의 조언 기다리고 있겠습니다. 감사합니다.
회원작성글 okop311529  |  2021.02.15
Q. NUP98과 LaminA/C의 차이?
Nuclear protein을 추출하고 나서 control로 nup98, lamin AC를 사용하는데요, 같은 세포 내에서 이 둘의 모두 사용하는 이유도 있을까요? 어떤 특성의 차이가 있는지 잘 모르겠습니다.
회원작성글 대학원생인가노예인가  |  2021.02.08
Q. 투석과 샘플버퍼 선정기준에 관하여
저는 현재 콜라겐 단백질을 추출하려고 하는 석사과정생입니다. 참고하고 있는 논문은 NaCl로 단백질을 염침전 시킨 후, 냉증류수를 통하여 투석을 실행하라고 되어있습니다. 그런데 제가 이전에는 투석에 관하여 잘 몰라서 공부중에 있는데 투석은 보통 샘플에 들어가는 샘플버퍼와 맴브레인 외부의 투석버퍼를 이용하여 하더라구요.   그러한 기준도 단백질마다 다 다르겠지만 그러한 투석 조건을 선정하는 기준에 관한 설명이 잘 되어있는 곳이 없어서 막막한 부분이 있습니다.   염침전한 콜라겐 단백질을 그저 냉증류수로만 투석해도 괜찮을지 아니면 적적절한 버퍼를 사용해야하는지 선배님들의 많은 조언 부탁드립니다...
회원작성글 okop311529  |  2021.02.08
Q. 코마시 염색 후 protein sequencing을 하려고 하는데요,
단백질은 SDS-PAGE 젤에 내린 후   코마시 염색 후 protein sequencing을 하려고 하는데요   타겟 밴드를 잘라낸 후,   상온 운송하나요? 아니면 ice 운송하나요?   어떤 방식이 잘 protein이 보존 되나요?   답변 주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 꿈꿈이  |  2021.02.03
Q. Protein prep for Western Blot 질문입니다. 너무 궁금해 미칠거같아요 ㅠㅠ
Western Blot을 위해 Protein prep을 하는 과정 중 궁금한 점이 몇 개 있어 질문드립니다. 아무리 구글링해봐도 명확한 답변이 없어 고수님들의 도움을 받고 싶습니다 ㅠㅠ    제가 사용하는 lysis buffer의 조성은 다음과 같습니다 Tris : pH 조절용 NaCl : Cl -> stacking gel에서 글라이신과 함께 같은 출발점에서  running될 수 있게 도와주는 역할 + 삼투압으로 인해 cell lysis를 일으키는데 기여  Trition X-100: ??? SDS: non-covalent bond를 끊어주고 protein에게 negative charge 부여 + 이온성 계면활성제로 세포막을 denature 시키는데 기여    제가 궁금한 점은  1. Trition은 비이온성 detergent인데 SDS와 마찬가지로 세포막을 denature 시킨다고 알고 있는데 SDS가 있는데 굳이 가져다 쓰는 이유가 무엇일까요...? 2. Lysis buffer 처리 후 vortexing을 여러번 하고 centrifuge를 돌려  supernatent를 따서 쓰는데 DNA나 RNA의 경우 (-) charge를 띄고 있을텐데 그놈들도 물에 soluable하기 때문에 centrifuge를 돌려도 물에 녹아  supernatent에 있어야하는거 아닌가요...? 왜 pallet으로 가라앉는건가요? ㅠㅠ     
회원작성글 Minuate  |  2021.02.02
Q. AU-PAGE gel에서 얻어진 단백질
AU-PAGE gel에서 얻어진 단백질이 6X loading dye로 염색이 되어 있는데, 이것의 색을 없애려면 어떠한 과정을 거쳐야 할까요? HPLC를 진행할 예정입니다.
회원작성글 택운자몽  |  2021.01.27
Q. 조직에서의 soluble insoluble protein
안녕하세요 대학원생입니다. 현재 조직에서 soluble과 insoluble protein 추출하여 bca로 측정하는 실험을 하고 있는데  어떤 논문에서는 조직무게를 잰 후 10% w/v으로 pbs에 homogenize하여 상층액을 soluble 남은 pellet에 1M NaOH를 가해서 나온 상층액을 insoluble으로 측정하고 있더라구요..   하지만 저는 몇개월째 soluble이 normal군과 control에서의 차이가 나야하는데 항상 비슷하게 나오고 있으며 insoluble은 잘나오는 편인데 어디서 잘못되고 있는지 잘 모르겠네요.. 혹시 다른 방법으로 측정해 보신 선생님들 코멘트 부탁드립니다...
회원작성글 초코딸긔맛  |  2021.01.22
Q. SDS PAGE 질문드립니다.
SDS PAGE에 대한 몇가지 궁금증이 있는데, 아시는분은 대답해주시면 정말 감사드리겠습니다.   (1) loading할때 저희 lab실에서는 15람다정도 loading을 하는데, 기준이 있나요? 그리고 sample에 원하는 protein이 많으면 loading을 적게 하는식으로 조절하는건가요? (2) 저희 lab실에서는 running할때, pre-running (stacking에 일자로 맞춰주는)을 안하고 120V에 2시간 running하는데 이렇게되면 결국 같은 MW의 protein이여도 일자로 안내려오지 않나요? (3) 높은 volt로 running하면 저항이 많이 발생하고, 열이 많이 발생하지 않나요? 근데 이럴때 부작용은 어떻나요?
회원작성글 갓석박사  |  2021.01.22
Q. exosome BCA 정량을 하려고 하는데요.
안녕하세요. exosome을 western을 하기 위해 BCA 정량을 진행했습니다.  exosome을 우선 protein으로 lysis를 해야 하잖아요. 그래서 ripa 5ul + exosome 5ul를 넣고 ice에서 30분 진행한뒤, BCA정량을 진행했습니다.  (혹시나 싶어서 ripa를 넣은 샘플과 넣지않은 샘플 둘다 측정을 진행했습니다.) 그런데 ripa로 lysis한 농도값이랑 그냥exosome을 넣은 농도값이  비슷하게 나옵니다. 그럼 lysis가 안된거라 생각해야 하나요? 둘다 OD값이 대략 0.1483 정도 나왔습니다. (양이 작으니 그건 감안해주세요.)   혹시 exosome을 protein으로 인지하는건가요?ㅜㅠ 도와주세요.. 감사합니다.
회원작성글 나는연구자  |  2021.01.19
Q. 단백질 보관법
안녕하세요 석사 2학기차 초보 대학원생입니다.. 단백질 뽑다가 의문이 들어서 질문 남겨요.. a549랑 beas cell을 가지고 INTRON사의 protein lysis buffer로 단백질만 뽑았습니다. 아직 BCA assay랑 western용 sample 제작 (5x sample buffer넣고 끓이기) 하지 않은 상태구요  이 단백질을 -80도씨에 보관하는게 괜찮을까요? 어제 딥프리저에 넣어두고 오늘 보니 얼어있더라구요  지금 현재 다른 실험들이 많아 이 단백질 sample로는 1달쯤 뒤에 western을 할 것 같습니다.. 고수님들 조언 부탁드립니다 1. 5x sds sample buffer 까지 넣고 끓인뒤 -80 보관 2. 단백질만 뽑은 상태에서 -80보관 3. 단백질만 뽑은 상태에서 -20보관  셋 중 어떻게 보관해야할까요? 조언 부탁드립니다. 감사합니다  
회원작성글 돔돔  |  2021.01.13
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