안녕하세요ㅠㅠ  western blot으로 고생중인 학생입니다...   detection을 하게되면 VC만 진하게 나옵니다 cell line은 C2C12이고 housekeeping gene은 GAPDH로 잡고있어요.. housekeeping gene이 일정하게 나오지는 않지만 그래도 VC랑 나머지 샘플들이랑 비슷하게 나오는데,,왜그럴까요??  특히 토탈폼찍을 때 저렇게 나와요 포스포폼은 나름 경향이 보이고 밴드가 찍히는데 말이죠..  VC / muscle atrophy유도 / muscle atrophy유도+샘플처리 1, 2, 3 -> 토탈폼  VC / muscle atrophy유도 / muscle atrophy유도+샘플처리 1, 2, 3 -> GAPDH 뭐가 문제인지 감도 안잡혀서 질문드려요ㅠㅠ 제발 답변 부탁드립니다!!

hl-60 세포를 이용하여 neutrophil-like cell로 분화 후 실험을 진행 중인 석사생입니다.. DMSO 1%로 4일간 분화 후 FACS로 CD11b 발현 차이를 확인한 후 분화 조건을 잡았는데요 문제는 분화 후 물질의 netosis에 대한 효능을 확인하고자 SYTOX GREEN으로 염색 후 multi-reader로 형광을 확인했을때입니다,, 분화 후 cell wash - count - sytox green 염색한 cell을 black plate에 seeding - 20min incubation - PMA 및 물질처리 - KINETIC 형광측정 순서로 진행했는데(전부 HBSS buffer 사용하여 진행) 형광 측정 초기에는 분화한 Non-stimulated cell CTL에서 NETOSIS가 강하게 일어나서 PMA와 비슷하다가 2시간부터 두 군의 차이가 나타나기 시작해 4시간에는 명확한 차이가 보였는데요 그런데 효능을 봐야하는 물질처리군에서 초기부터 KINETIC 마지막까지 Non-stimulated cell CTL보다 훨씬 낮은 수치입니다,,  도대체 이유를 모르겠습니다,,ㅠㅠ 조건을 조금씩 바꿔봐도 같은 경향이어서요,,  혹시,, HL-60이 dmso로 분화만 시켜도 netosis를 강하게 일으키나요? 제가 찾았던 논문에서는 아니었는데,,, 정말 답답해요 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ    첨부한 사진은 DATA TEST 결과입니다 4시간대 위로 올라간게 PMA 처리군, 그 아래가 Non-stimulated cell CTL, 제일 아래가 물질처리군입니다,, 

안녕하세요 western blot을 할 때 몇 % gel을 쓸지와 하나의 well 당 몇 ug/ul의 protein을 넣을지 는 어떻게 설정하는건가요? 현재 보고자 하는 항체의 사이즈가 37, 72, 151 kDa이고 가지고 있는 단백질 총 volume이 30~50ul 정도인데 단백질의 농도는 1~5 ug/ul 정도로 낮아서 몇을 넣어야할지 고민입니다.. 

순도와 시퀀스도 분석이 가능한 곳이 있다면 견적 메일 주실 수 있을까요? 2개의 시료고 하나는 22k 다른하나는 7k 의 분자량 입니다. rndtradeco@gmail.com

washing을 오래하긴 했는데 membrane에 같이 넣은 마커는 보이는데 전기영동 시 단백질 위치 알게 포함된 bromophenol blue가 흔적도 없이 사라졌는데 혹시 워싱 과정에서 단백질이 떨어져 나갈 수 있는지 궁금해서 올려봅니다. 

자료를 찾아봐도 아직은 너무 초보라 결과 해석이 어려워 문의드립니다 TRIzol 이용한 RNA 추출 실험 결과입니다 (A260/A230 2.182, A260/A280 1.939, Concentration 2.000) 수치상으로 보면 추출이 잘 된 것 같은데 밴드 보는 방법을 모르겠습니다 21조 밴드 결과 해석 부탁드립니다      

답변주신 전문가님들 감사드립니다.^^ 1번. 질문 학생들이 어떤 제품에 들어있는 Triclosan이 엠피실린 내선을 유발한다고 하는 연구논문을 봤는지 FDA에서 쓰지 말하고 한 Triclosan이 함유된 손소독제나 청결제품을 좀 구해서 대장균을 키운후 엠피실린을 접종한뒤 살아남은 부분이 많은 배지를 고르더라구요.. 의미가 있는 실험인가 해서요 돌연변이는 이루어 질수 없는 기전이라 어떤 의미를 찾아야 되는지 질문입니다.   2번질문 다른실험관련입니다. Trypan blue용액으로 어떤 죽은 세포와 살아있는 세포를 Haemocytometer Cell Counting을 할때 고체배지에 있는 세균을 씻어낼때 trypsin-PBS로 씻어내듯 해서 하는 건가요? 고체배지에 큰 균을 어떻게 작은 샘플통에 넣을지부터 막막해서 여쭤봅니다.

안녕하세요 DNCB로 BALB/c 아토피를 만들어서 spleen에서 Th1/2 확인하려 합니다. 완전 처음이고 랩에 세팅하는거라 도움이 절실합니다   1. 제가 구입하려는 antibody가 아래 4가지입니다. 다 mouse detection antibody예요     CD3-FITC (Rat, IgG2bk), CD4-APC-eFluor780 (Rat, IgG2bk)     IL-4-PE (Rat, IgG1k), IFN-r-APC (Rat, IgG1k)     4분면(?) 나눌때 control isotype이 필요하다고 하는데 그럼 저는 IgG2bk-FITC, IgG2bk-APC-eFluor780, IgG1k-PE, IgG1k-APC 이렇게 4가지를 다 Rat으로 구입해야 하는건가요??   2. spleen에서 세포를 꺼내서 10% FBS/RPMI1640에서 PMA, Ionomycin으로 자극할건데 옆방 박사님이 10%면 너무 높다고 사이토카인이랑 이것저것 많아서 FBS를 줄이라고 하시는데 이해가 잘 안 갑니다,,, 그리고 DNase를 넣으면 좋을 것 같다고 하시는데 왜 넣어주는 걸까요,,??   3. FACS buffer는 FBS 2%, NaN3 0.1% in DPBS 사용하려고 하는데 사용해도 되는 농도인가여??

 LB Broth에 ampiciline넣은 액체배지 빛차단해서 냉장보관시 유효기간이 얼마나 될까요? 2022.10월에 보관한것인데 ecoli키워도 될까요?

Rat 흉부대동맥 vascular smooth muscle cell 을 primary culture해서 실험에 사용하고 있는데요.. passage #5-6정도 까지 subculture해서 실험에 사용하려고 seeding 했는데 cell이 잘 붙지도 않고 seeding 하면서 100파이에 subculture한 같은 cell도 모양이 기존것과 다르게 보여요. 보통 손을 뻗는? 모양이라고 해야하나 그런데 그냥 점만 찍혀있는듯하고 작은 삼각형 모양이요.. 다른 때에 primary culture해서 얻은 cell은 같은 방식으로 seeding하고 subculture해도 정상적으로 cell도 잘 붙고 모양도 괜찮고 실험도 잘 되는데 유독 이 cell만 그러네요.. 이유 아시는 분 계실까요ㅠ

안녕하세요 HDF cell line에서 10J/cm^2으로 uva를 조사한다고 하면, 세포배양하는 dish의 면적이 9cm^2이라고 할때, 90joules를 조사하는건가요?? 답변부탁드립니다ㅜㅜ!

항생제 내성 관련 실험으로 세균돌연변이주가 있는지 검증하려고 합니다. 셀배양을 하고난 후 항생제를 넣은 다른 배지에 세포를 배양 그이후 일부 살아남은 세균이 있다면 변이가 생긴걸까요? 항생제를 계속 접종하면서다른 배지에 옮기는 과정을 몇번 정도 해야될지 질문입니다.

TNF-α recombinant human protein unit(IU)를 봤는데 회사마다 specific activity가 다르게 나오는데 회사마다 다를 수 있는 건가요? unit 단위는 drug 특성이라 같은물질(예로 TNF-α)이면 같은 specific activity를 가지는줄 알았는데.. 만약 그럼 저렇게 bio activity가 안써져있는 회사 물질은 어떻게 계산하여 쓰는걸까요        

 pCambia1391Z vector 를 구합니다. 해외 주문해도 너무 오래걸려서요. 혹시 있으신 분은 imspirits@daum.net 보내주세요. 제가 찾는 게 맞다면 제가 소정의 보답 드릴게요.  

cloning하는중에 clone size확인하려고 agarose gel에 샘플 loading후 voltage는 어느정도로 하는지요? 빨리 달리기 위해 200V는 너무 빠른가요? 사이즈에 따라 적정 전압이 있는지 궁급합니다 감사합니다.

안녕하세요. Target gene 보다 좀 더 바깥쪽으로 primer를 design하려고 합니다. 그런데 NCBI에서는 유전자 서열들만 나오고, flanking sequence 검색이 안되네요 ㅠㅠ 혹시 어떻게 찾을 수 있는지 아시는 선배님들 계실까요?