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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
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Q. IP할 때 antibody의 affinity에 대해서
Immunoprecipitation을 처음으로 셋팅하고 있는 석사생입니다.A가 B와 binding하는 것을 확인하려고 하는데 antibody로 A를 당겨야 할지B를 당겨야 할지에 대해서 교수님은 bead와 binding affinity가 더 좋은 것을 당기라고 하시는데..그게 무슨 말인지 잘 이해가 가질 않습니다 ㅜㅜ어떻게 antibody의 binding affinity가 더 높은 지 확인할 수 있나요??ㅜㅜ고수님들 답변 부탁드립니다~ㅜㅜ
버섯  |  2016.09.20
Q. IP를 했는데, input 사이즈가 살짝 다릅니다..
유전자 A 로 IP 를 하고, 유전자 B로 웨스턴을 진행하였습니다. B의 사이즈는 약 100kd 정도 되는데, IP 밴드가 INPUT 보다 살짝 작게 나왔는데요.. 이런 경우도 있나요..? IP 가 잘됐는제 유전자A 항체로도 확인했는데(23kd), 이 밴드는 IP와 INPUT 밴드가동일하게 나왔습니다.. heavy chain, light chain  분리되지 않게하려고, beta-ME 을 넣지 않은 sample buffer 를 사용했는데 이 영향이 있을까요..? 조언부탁드립니다 ㅜ
학생  |  2016.09.07
Q. immunoblotting 해석
gst tag과 flag tag 쓴 단백질에서 먼저 gst pull down 을 통해 anti-gst와 anti-flag 단백질을 detection 하고 total cell lysate을 anti-flag을 사용했는데 이 과정이 이해가 안됩니다 ㅠㅠ cell lysate에 항체를 왜 사용했는지요ㅠ
회원작성글 minija  |  2016.08.04
Q. 공백터 공비드.. 왜 넣어주는건가요??
transfection할때 클로닝된 백터 이외에 공백터를 넣어 total DNA양을 맞춰주었습니다.그리고 GST pull down assay하기위해 coomassie blue staining으로 정량(?)한 이후 원하는 만큼 sample을 취한뒤 공비드를 넣어 total 비드 양을 맞춰주었습니다.위의 두가지 경우에서 왜 공백터와 공비를 넣어 total DNA와 비드 양을 맞춰주는건가요?
컨트롤  |  2016.07.01
Q. Protein Protein interaction을 보기위해 His tag을 단 단백질을 정제했습니다.
제가 Protein Protein interaction을 보기위해 His tag을 단 단백질을 정제했습니다.그래서 His-A(Protein)을 정제했는데, 이는 A와 B단백질간에 Direct 한 binding을 하기위해서 했는데요...His-A와 B protein을 IP를 해서 binding을 보고 싶은데..His-A와 B가 들어있는 cell lysate를 incubation 시킬때, anti- his antibody와 합께 incubation 시키는게 맞는지 와,이때 Bead로 그냥 Protein G agarose를 Ni-NTA Bead대신 사용해도 되는지을 알려주시면 감사하겠습니다~아! 그리구 his-A 양을 cell lysate에 얼마나 넣어주어야하는지도 알려주세요~~혹시 이와 관련된 실험 방법 link도 알려주신다면 정말 감사하겠습니다~
회원작성글 phaein0411  |  2016.05.23
Q. 단백질 destaining한후에!!
안녕하세요여쭤볼께있어서요!!!단백질을 정제하는데 제가 원하는 사이즈외ㅔ 다른사이즈의 밴드 발생합니다 sds page로 내린후에 그 부분만 잘라서 디스테이닝으로 하고나면 그 단백질을 이용할 수 있는건가요? 열처리한후에 내리는거라 어렵겠죠? DNA의 gel extraction처럼 자른다음 다시 쓸수있는 방법은 없나요? 제가 단백질에서 기초적인것도 잘 몰라서요 ...ㅜㅜ급하게 여쭤봅니다ㅠㅠ
회원작성글 2847  |  2016.05.21
Q. IP 고수님들 모십니다.
 안녕하세요, 늘 브릭 게시판에서 눈팅하며 많은 도움을 받고 약간의(?) 도움이 되고 있는 석사과정생입니다.동물세포를 가지고 ip를 하는 중입니다.그런데, pre-clearing 과정에서 실수로 normal IgG가 아닌 HRP-conjugated IgG (흔히 말하는 2차항체)를 넣고 protein G로 끌어내렸습니다...끌어내린 뒤 뒤늦게 실수를 깨달았는데요.혹시나 하는 마음으로 clearing 후 모아놓은 input과 버리려고 빼놓은 protein G bead에 ECL을 넣고 발색시켜봤는데, 이번에 알게된 사실인데 2차항체도 protein G로 끌어내릴 수 있더군요. HRP가 Fc region을 많이 가려버리는 것은 아닌 것 같습니다.질문은 이겁니다."타깃을 인식하는 1차항체에 2차항체가 붙어있는 상태에서 protein G가 1차 또는 2차 항체의 Fc 부분에 붙어서 ip가 가능해질 수 있을까?"저는 가능하다고 생각하는데, 경험많으신 선배님들 중, 쪼랩때 저와 비슷한 실수를 하신 분이 계시면 경험을 나누어주시면 감사하겠습니다.다들 좋은 실험결과 있길 바라겠습니다.
IPㅠㅠ  |  2016.03.06
Q. BN-PAGE를 하고 있는데요, gel로 protein이 들어가질 않네요.
BN-PAGE를 시작하고 있는 실험실입니다.처음에는 well에서 걸려서 들어가지 않길래 논문 찾아보니 버퍼나 salt 문제라 해서 버퍼 바꿔주고 다시내리니 stacking gel 까지는 들어갔습니다.그런데 gradient gel 에는 들어가질 못하고 있네요. stacking과 gradient 사이에 걸려있습니다. stacking 내려온 뒤에는 400V로 o/N해 주었습니다. gel을 만들어서 쓰고있는데 무슨 문제가 있는 걸까요?고수님들 답변해 주세요.
회원작성글 피곤피곤해  |  2016.02.23
Q. GST-tagged protein 얻는 방법
제가 GST Pull-down assay 를 하려고 kit를 구입했습니다 (thermo제품). 그 kit 하나로 다 해결이 되는 줄 알았는데, GST-tagged protein은 제가 따로 준비를 해야 되는 거더라구요. ㅠㅠ그래서 여쭤봅니다. 그걸 어찌 준비를 해야 하는지요? cloning을 해야 하는 건지요? 아님 구매하는 방법은 있는지요? 처음 하는 거라 방법에 대해 읽어도 뭔 소린지 몰라서 여기에 올립니다. ㅠㅠ 도와주세요~~~
구슬이  |  2016.02.22
Q. kinase assay를 위한 단백질 정제
tag가 달린 단백질의 plasmid를 293T cell에 transfection 후 이 단백질(kinase 및 substrate)을 IP하여 32P-ATP를 이용한 kinase assay를 하려 합니다. 처음이라서 드는 질문인데.. 1. 단백질이 bead에 붙은 상태로 써도 되나요? 다른 실험실에 물어보니 kinase가 substrate에 접촉하는 확률을 되도록 높여야 하므로 kinase 쪽은 bead를 제거하는 게 좋겠다고 해서 그렇게 할 생각입니다만... Anti-Flag bead 같은 경우 Flag peptide로 competition 하여 elution 할 수 있어서 kinase에는 Flag tag를 붙일 생각입니다. 다른 bead는 glycine으로 elution 하는데 이 경우 pH를 낮춰야 하는데 이게 단백질의 기능에 영향이 미칠 수 있으려나요?  2. bead 붙은 상태로 써도 된다면, agarose bead든 magnetic bead든 상관이 없나요?3. 만약, kinase와 substrate 둘 다 bead를 제거하는 게 좋다면 둘 다 같은 Flag tag를 붙인 상태에서 발현시키고, competition에 의한 elution을 해서 써도 되려나요? 4. 단백질을 정제한 후 냉동실에 며칠 보관했다가 kinase assay에 써도 될런지요? 동위원소의 반감기 문제도 있고, 조건을 다시 잡아야 될 경우가 생길 것 같아 여러 번 쓸 만큼의 단백질을 미리 IP 해 두려고 하거든요.
회원작성글 sean  |  2016.01.20
Q. Blue Native Page 할 때 Marker는 어떤걸 사용하시나요?
bn page 시작해 보려 하는데 아무래도 SDS page 할때와는 마커 사이즈가 커져야 할거 같아서요.구매하여 사용하고 계시면 thermo 제품 외에 다른 제품 사용하시는데 있나요?검색해보니 떠모 제품만 찾아지네요..;;
회원작성글 피곤피곤해  |  2016.01.18
Q. IP를 처음 해보려고 하는데요^^;;
안녕하세요?western을 하다가 밴드가 잘 안잡혀서교수님께서 protein 농도가 적은 거 아니냐고Immunoprecipitation을 해보라고 하셔서 이번에 처음 시도를 해보려고 합니다ㅠㅠ프로토콜은 어째어째 찾았는데제가 이해를 잘못 하고 있는지는 몰라도원리상으로는 항원-항체 반응시켜서 특정 단백질만 뽑아내는거잖아요^^;;그러면 loading control로 걸어주는 GAPDH 같은 것들은제가 특정 프로테인에 대한 항체랑 비드로 IP를 한 후의 샘플에서는못보는 거 아닌가요?GAPDH는 그럼 IP 안하고도 원래 잘 보이니까그냥 Total protein에서 western으로 loading control 로 보여주고IP는 별도로 해야하는건지...아니면 A라는 프로테인에 대해서 항체랑 비드로 IP 할 때별도의 샘플을 한세트 더 준비해서 GAPDH 항체랑 비드도 같이 IP를 해주고그렇게 두 세트를 IP 후에 WESTERN 해서 봐야하는건지..모르겠습니다ㅠㅠ조언 부탁드립니다.
IP쌩초보  |  2016.01.13
Q. IP lysis 및 lysis buffer 질문드립니다.
안녕하세요 co-IP를 연습중인 초보석사생인데요lysis에 문제가 있는것 같아 질문드립니다.우선 SDS가 들어있지 않은 lysis buffer 를 사용중인데요조성은 다음과 같습니다.50mM Tris-HCl pH7.41% NP-400.25% sodium deoxycholate150mM NaCl1mM EDTA(protease phosphatase inhibitor)제가 드는 의문점은 Lysis 후에 펠렛이 생각보다 많고단백질 농도 또한 세포 양에 비해 현저히 낮게 나오는데요제가 쓰고 있는 버퍼가 핵막까지 완벽하게 분해할수 있는지 궁금합니다. 이상하게 생각하는 이유가, lysis 후 생기는 펠렛이 마치Nuclear/cytosol fractionation 할때 cytosol part만을 분리했을때의 펠렛과굉장히 유사하고 느꼈기 때문입니다..또한 lysis 시에는 interaction에 영향을 주지 않으려고vortex를 전혀하지 않고 파이펫으로만 하고있는데요이또한 맞는 방법인지 궁금합니다..IP 선배님들 답변 부탁드려요 ㅠㅜ
회원작성글 초보석사  |  2015.11.17
Q. direct protein-protein interaction 질문드립니다.
Protein A와 protein B의 interaction 을 보고 있습니다.   특정 reagent를 처리한 cell을 lysis 시켜서 endogenous protein A와 protein B가 interaction을 하고 있음을 IP assay (IP: protein A antibody -> IB: protein B antibody)를 통해 확인했습니다.   다음으로 A와 B가 direct interaction임을 보이기 위하여 GST-pulldown assay를 하였습니다. Protein A의 ORF를 pGEX vector에 cloning 하여 BL21 E.coli에서 IPTG induction 하여 GST-A 를 얻고, Protein B의 ORF에 FLAG tag을 붙여서 pcDNA3.1-FLAG-B 를 만들고 TnT Quick master mix (Promega)를 사용하여 in vitro transcription/translation 하여 FLAG-B를 얻었습니다. GST-A와 FLAG-B를 binding 시키고 pulldown 하여 (A가 달려있지 않은 GST control 도 같이…), SDS-PAGE에서 anti-FLAG antibody를 사용해서 immunoblotting를 해 보니 정확한 위치 (FLAG-B 0.5% input 과 동일 위치)에서 FLAG-B 가 잡혔습니다 (물론 only GST control 에서는 band 가 없습니다). 결과적으로 A와 B 가 direct interaction 이라고 결론 내렸습니다.   그런데 실험을 하면서 드는 생각이.. pGEX vector 로 cloning을 하고 GST fusion protein을 뽑는 등의 수고를 하는 대신, 만약 pcDNA3.1-Myc-A, pcDNA3.1-FLAG-B 이 있을 경우, 각각을 in vitro transcription/translation 하여 Myc-A와 FLAG-B를 얻어  binding 시키고, IP: Myc -> IB:FLAG을 하여 FLAG-B size에서 band 를 볼 수 있다면.. 이것이 GST pulldown 보다 더 쉽고 간단하게 direct interaction을 볼 수 있는 방법일 수도 있다는 생각이 듭니다.   그런데 대부분 논문을 보면 각각을 in vitro transcription/translation 하여 IP assay를 하는 것 보다, GST pulldown assay를 하던데요... 이유가 있는 건가요? 후자의 경우 direct interaction 이라고 주장할 수 없는 상황인가요?
protein  |  2015.11.05
Q. Bradford assay에서 Microassay, Standardassay 농도질문
실험실 초보고 Bradford assay를 처음하는데요궁금한점이지금 Bio-rad 제품 이고 Dye는 Coomassie blue G-250, standard는 BSA입니다네가지 프로토콜이 있던데Standard / Microassay / Microtiter plate standard / Microtiter plate microassay각각 농도사용 요약을 하면요 Standard assay Microassay BSA 100ul 10ul Dye 5ml 200ul Range 0.2~0.9mg/ml 0.05~0.5mg/ml Microplate Standard Microplate Microassay BSA 800ul 160ul Dye 200ul 40ul Range 1.2~10.0ug/ml 8~80ug/ml근데 저 수치가 전혀 이해가 안되요 ㅠㅠ 일단 Standard와 microassay의 저 넣어주는 양의 차이가 왜 저렇게 되는지도 모르겠고요 ㅠ 그리고 BSA를 일정 농도로 dilution해논 상태에서 Dye를 넣어주면 토탈 볼륨이 변하니까 농도가 또 바뀌잖아요 그걸 계산을 한번 쭉해보고 싶은데 감이 안잡혀서 대략적으로 한번만 팁을 주시면 감사하겠습니다. ㅠ
회원작성글 에우로파  |  2015.10.27
Q. IP elution 관해서 질문좀 드립니다.
안녕하세요 IP 실험 하려고 셋팅중인 석사생입니다. IP를 시행하는데요 처음이라 아는게 많이 부족합니다 magnetic beads랑 magnetic rack을 사용하려고 하고 이미 binding이 되는 걸로 알려진 protein들의 증가 및 감소를 보려고 준비중 입니다.protein A와 B or C or D 와 결합 한다고 알려져 있어서 IP로 A를 잡고 나머지 binding protein들의 약물에 의한 감소를 보려고 합니다이 경우 elution 할때 1X sample buffer로 boiling 해서 elution 해도 상관 없을까요? non-denaturation, denaturing-reducing 등등 elution종류가 있던데 어떤게 저한테 맞는 방법인지 모르겠습니다.  그리고 Thermo IP/Co-IP kit에 보면 sample buffer로 boiling하면 rabbit antibody를 쓰지말라고 되어있던데(일차, 이차 모두),,,이유가 있는지 궁굼합니다 그 회사 제품만 해당 되는 걸까요? 저는 biorad 제품을 쓰려고 합니다.초보적인 질문이라 죄송합니다 물어볼만한 곳이 없어서요 ㅜㅜ조언 좀 부탁드립니다.
석사나부랭  |  2015.10.01
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