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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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Q. 정제한 단백질 잠깐 보관시 어디에 두는게 낫나요?
정제한 단백질을 투석 후 6시간 정도 일이 있어서 두려는데 1. 투석 버퍼에 4도씨에 그대로 둔다 2. 농축 후 농축막에 둔다 시간이 애매해 농축을 다 못 끝내고 가게 될 거 같아서 고민이네요 혹시 어떻게 두는게 더 나을까요??
회원작성글 기적  |  03.02
Q. 단백질 투석이 완료된걸 어떻게 확인할 수 있나요??
안녕하세요. ni-nta 정제 후 이미다졸 제거를 위해 dialysis를 하고 있는데 어느 정도가 돼야 투석이 완료됐다고 할 수 있는지 잘 모르겠어서 질문드립니다. 저는 imidazole 20 - 250 mM로 정제했고 40 mL 정도를 모아서 투석을 진행하고 있습니다. 현재 2 L, 3 h -> 2L, overnight -> 2L, 4 H 진행하였는데 4시간 후 한번 더 4시간 투석 후 종료할까 하는데 맞는지 여쭤보고자 질문드립니다. 그리고 하나 더 여쭤보고 싶은게 있는데, 총 40 mL 라면 10 *4 로 나눠서 2 L 버퍼에 한번에 넣어 투석하는게 전체를 넣어서 하는 것 보다 더 효율이 좋을까요? Q1. 위에 적은 조건으로 투석을 4번 진행하면 끝내도 될까요? Q2. 총 40 mL를 투석한다면, 10*4개로 나누어 2 L 버퍼에 한번에 넣고 투석하는게 효율이 좋을까요? 답변해주시면 정말 감사하겠습니다.
회원작성글 기적  |  03.01
Q. 단백질 발현 온도의 영향에 대해 여쭤봅니다.
안녕하세요. 현재 ni-nta 정제를 하고 있는데 문제가 생겨 여러가지 해답을 찾아보다 궁금증이 들어 질문글 올립니다. 단백질 발현시 여러 조건을 검토하는데 그 중 발현 온도가 단백질의 안정성에도 영향을 끼치는지 여쭤보고 싶습니다. 현재 30도, 0.1 mM iptg 에서 가장 발현양이 많아 이 조건으로 대량발현하여 정제를 진행하고 있는데, 정제->투석->농축 후 활성이 거의 사라져버립니다. 그래서 18도로 발현을 하면 단백질이 천천히 발현이 되니 구조적으로 더 안정하여 정제 후 활성을 유지할 수 있을까 하는 궁금증이 들었습니다. 혹시 영향을 미쳐 정제 후 더 안정성을 유지할 수 있을까요?
회원작성글 기적  |  02.28
Q. 단백질 정제 중 단백질 확인 가능한 방법이 있을까요??
단백질 관련 실험을 하였는데 ... 정제관련 시약에 문제가있어서 추출하고자 하는 단백질이 많이 않나와서 재실험을 들어가야 합니다 ㅜㅜ  정제후.. buffer change 후 정량을 해야만  추출된 단백질 이 확인 할 수 있는건지 ㅠㅠ  아님 정제후 elution 후 BCA정량을 하고 buffer change 를 진행해야 하는 걸까요?? 중간에 확인 할 방법이 있을까요??
회원작성글 mito59  |  02.25
Q. 단백질 정제 질문드립니다ㅠㅠㅠㅠ
단백질 정제할때 1L 배지에 starter랑 KAN 넣는 과정에서 1L 배지에 KANx1000를 1ml 넣어야하는데 2ml를 넣어버렸습니다... 이렇게 해도 괜찮은 건가요..?  vector에 selection marker에 KAN 저항성이 들어가 있긴 한데  너무 많이 넣어서 다 죽어서 안자랄까봐 걱정입니다...
회원작성글 mini64  |  02.23
Q. 단백질 정제 후 활성을 잃었습니다..
안녕하세요. 단백질 정제를 하고 있는 대학원생입니다. 첫번째로 시도한 ni-nta 정제에서 20 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0), 500 mM NaCl, imidazole (20-250 mM gradient) 사용하였습니다. dialysis buffer는 20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl (pH 7.4) 였는데 투석 중 침전이 제거해도 계속 생겨 결국 효소 활성이 거의 사라졌습니다. ( 정제할때 fraction별로 활성 측정했을땐 활성을 보였습니다) 그래서 두번째로 할 때는 정제 버퍼 자체를 300 mM NaCl로 농도를 낮추고, 모든 버퍼에 5% glycerol을 넣어주었습니다. 그랬더니 정제, 투석 과정 중에서는 침전이 거의 생기지 않았습니다. (조금 생기긴 함) 그래서 성공했구나 생각했는데 농축 후 활성 측정을 하니 활성이 너무 낮아졌습니다.. (100 ul 반응에 20 ul 사용합니다) Q1. 300 mM과 150 mM NaCl로 투석한 효소들의 활성을 비교해보면, NaCl의 농도가 효소의 활성을 저해하는 것은 아닐까요? 그런데 그렇다고 치면 lysis buffer로 binding buffer와 같은 것을 쓰는데 말이 안 되는거겠죠? Q2. 그리고 다른 질문인데, 500 mM NaCl로 정제했을땐 거의 단일 밴드 였는데 300 mM NaCl로 정제하니 밴드 2개가 같이 정제되더군요.. 이럴땐 NaCl 농도를 높여 unspecific binding을 막아야하는게 맞겠죠?? 혹시 이런 경험 있으신 분들은 어떻게 해결했는지 공유 부탁드리겠습니다..ㅠㅠ 혹시 몰라 정제 테이블도 같이 올려두겠습니다 !!
회원작성글 기적  |  02.16
Q. Dilaysis를 하고나서 protein을 정량하였더니 아무것도 detection되지 않습니다!
안녕하세요!!  protein과 관련된 일을 하고 있는 석사생입니다. 제목처럼 protein을 purification한 뒤에(SDS-phage gel로 확인) PBS로 dialysis하였습니다. 이때 aggregation이 된 것을 흰색의 뭉쳐져 나오고 있는 것을 통하여 확인하였습니다. 그리고 나서 bradfordassay를 통하여 정량하였는데 말그대로 protein들이 보이지 않습니다ㅠㅠ   protein들이 전부다 aggregation되었다고 볼 수 있을까요?? (평소 다른 protein들을 dialysis 할 때도 aggregation이 되는 애들도 있지만 그렇다고 아예 detection되지 않았던 적은 없었습니다.) 이번엔 dialysis를 엄청 오랫동안 진행했었는데(3일정도), 이것또한 어떤 영향을 끼칠 수도 있을까요?? 긴 글 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 어릴적올챙이  |  02.13
Q. Yeast 에서 intron이 포함된 유전자 발현
안녕하세요? Yeast 에서 intron이 포함된 native 유전자를 유전자의 promoter 및 terminater가 아닌, host 내의 다른 promoter 및 terminater로 발현하였는데, 발현이 되지 않았습니다.  그래서 지금은 1. ORF 기준으로 앞 500 bp 및 뒤 500 bp가 포함되게하여 알아서 splicing이 일어나도록 design  2. Exon 부분만 처음과 동일한 promoter 및 terminator 가 포함되도록 design 이렇게 두가지 방법으로 진행하려고 합니다. 제 질문은 왜 첫번째 경우 발현이 되지 않았을까요? (promoter및 terminator는 본래 이 host에서 자주 쓰는 것입니다.) splicing 할 때, 본인 promoter가 필요한가요?  감사합니다.  
회원작성글 큐에이엠  |  02.09
Q. 단백질 정제 후 투석시 침전이 생깁니다..
안녕하세요. 매번 많은 도움을 받고 있는 대학원생입니다. 현재 단백질 정제를 진행하고 있는데 문제가 생겨 이렇게 질문 글을 올리게 됐습니다. Ni-NTA를 이용하여 his tag 정제를 진행하고 정제까지는 잘 됐습니다. 그런데 정제 후 투석을 할때 계속 침전이 생기네요..ㅠㅠ 버퍼 갈아줄때마다 침전물 제거해주고 다시 투석하고 속도도 낮춰보았지만 소용이 없었습니다. 그리고 농축을 하니 또 침전이 생기네요.. elution buffer는 20 mM NaPB, 0.5 M Nacl, 250 mM imidazole (pH 7.9) 였고 Dialysis buffer는 20 mM NaPB, 150 mM Nacl (pH 7.4)였습니다. 급격한 pH 변화도 아닌 것 같고, 등전점 확인해보았을때 pH 5.4로 pH 문제도 아닌 것 같은데.. 이건 어쩔 수 없는 이 단백질의 특성일까요? 혹시 투석, 농축 시 침전을 줄일 수 있는 방법을 아신다면 알려주시면 정말 감사하겠습니다..
회원작성글 기적  |  02.06
Q. HMW, LMW 질문 드립니다
안녕하세요 얼마전 바이오 회사에 입사하여 정제팀에 들어가 용어 공부하고 있는 사회초년생입니다.  HMW LMW의 사전적 의미, 그니까 고분자량 저분자량 이런 사전적 의미는 알겠으나 정제쪽에서 어떻게 적용되고 그에 따른 분리방법과 어떤 컬럼에 쓰고 장단점은 무엇인지가 궁금하네요 예시가 있었으면 좋겠습니다..!
회원작성글 프로티움루시  |  02.03
Q. SDS-Page marker 크기 분류법에서 막혔습니다 도와주세요
본실험에서 SDS-Page 에 사용되는 marker 를 단백질 크기별로 분석중인데 단백질을 사이즈별로 찾는 법을 알고 싶어요
회원작성글 의료신소재바이오  |  01.25
Q. Ni-NTA Resin binding 시간
cell harvest 후 soniacation을 이용하여 cell을 lysis 시켜주고 centrifuge 돌린 다음에 sup만 따서 resin과 binding 을 시켜주는데 이때 protocol에는 1~2시간 천천히 rotation 시켜주면서 하라고 되어있더라구요, 그런데 제가 갑자기 급한 볼일이 생겨서 resin binding 시간이 3시간 이상으로 늘어나도 괜찮을까요...? 물론 4도씨에서요!
회원작성글 냥뮹  |  01.20
Q. PTP1B inhibitor kit를 이용해 실험을 진행중에 질문이 있습니다
실험을 진행하는 중에 PTP1B substrate가 모자라 substrate만 재구매하려고 합니다. 키트에서는 PTP1B Substrate, IR5 isulin receptor 베타 residues 1142-1153, pTyr-1158를 사용하였는데 구글을 통해 PTP1B Substrate를 검색하면 DADEpYLIPQQG; [pTyr992] EGF receptor (988-998)가 나옵니다. https://www.scbt.com/ko/p/ptp1b-substrate-substrate 이 PTP1B substrate를 통해 실험을 진행해도 되는지 궁금해서 여쭤보게 되었습니다.   아님 PTP1B Substrate, IR5 isulin receptor 베타 residues 1142-1153, pTyr-1158를 사용해야할까요?? https://www.bioscience.co.uk/product~56193 
회원작성글 ghka14  |  01.14
Q. Sds page gel loading
His tag 단백질을 ni-nta resin으로 정제 후 sds page gel로 확인을 하려고 하는데요 저는 항상 cell lysis 후 pellet을 200 uL 정도 희석 후 20uL만 따고 sup도 20uL 딴 후 5X dye 5uL랑 boiling 후 loading하는데요.. 다른 교수님께서 total (cell lysis 후 centri를 돌리지 않은 상태) 도 같이 걸어보라고 하시더라고요 밴드 진하기가 total = pellet + sup 이 되어야한다구요 그러면 pellet을 희석하지 않은 채 loading하는 건가요..? 그리고 beads도 같이 걸어보라고 하시는데 bead도 그냥 희석없이 dye랑 boiling 후 loading하면 되나요..? 너무 간단하고 기본적인 질문이라 질문하기도 좀 그렇지만 ㅠㅠ 알려주시면 감사하겠습니다..!!
회원작성글 냥뮹  |  01.10
Q. SDS PAGE를 하는데 파란줄이 생깁니다 첨부파일
Sds page를 진행을할때, 계속 다음과같은 파란색 줄이 생기는데, running gel 만들때 시약이 잘못되서 그런걸까요? 1x running buffer도 새로만들고, tris-hcl문제라고 하시는 글을 봐서 바꿔서도 해봤는데, 계속 생깁니다..ㅠㅠ 단백질 농도가 진한것 때문에 생기는것 같아 ladder 기준으로 6번째 단백질은 희석해서 들어간건데, 그쪽부분에도 파란줄이 생겨 질문드립니다.
회원작성글 닁닁  |  01.06
Q. 단백질 정제시 버퍼 pH는 마지막에 맞춰도 되나요?
안녕하세요. his-tag 정제를 하고 있는 대학원생입니다. buffer조성이 sodium phosphate, nacl, imidazole인데 최종 pH를 7.4로 맞추려고 합니다. 각각의 용액을 그냥 몰수에 맞게 만든 후 세 개의 용액을 섞은 다음 7.4로 맞춰도 되나요?? 아니면 각각을 모두 7.4로 맞춘 후 세개 용액을 섞어야할까요? 도움주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 기적  |  01.06
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