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Q. mouse ESC 분주시 발생한 문제 질문
안녕하세요.   제가 ATCC에서 구입한 mESC(ES-E14TG2a)를 배양하면서 문제가 생겨 질문 남깁니다. 발생한 문제는, 세포를 처음 해동하고 풀었는데, 하루가 지나도 부착되지 않고 부유한 상태로 존재하고 있습니다. 원래 embryonic cell을 배양할때, 분화를 방지하고 세포 부착을 위해 feeder cell을 공동 배양하게 되는데, 저는 이후 실험을 위해 feeder cell을 사용하지 않고, 0.1% gelatine solution [biological industry] 제품과 LIF [sigma] 를 이용하였습니다. Gelatin coating의 경우 제품 사용 정보와 같이 면적에 충분한 solution을 넣었으며, 인큐베이터 (37도씨)에서 1h 정도 보관 후 gelatin solution을 suction하고 media를 넣고 cell을 seeding하였습니다. (혹시나 여기서 gelatin coating에 문제가 생길 수 있는 점이 있다면 말씀 부탁드립니다.) Media 조성에 대해서는, 기존에 나와있는 논문을 그대로 참고하여 다음과 같이 제조하였습니다. KnockOut DMD main media 1) 15% KnockOut Serum Replacement 2) 2 mM L-Glutamin 3) 1 mM MEM NEAA 4) 100 uM beta-mercaptoetanol 5) 1% P/S 6) 1000 unit/ml LIF 7) 1 uM PD0325901 8) 3 uM CHIR99021 ------------------------------------------------ 배지를 제조 하였을때, 전체적으로 색이 많이 노란색을 띄었습니다. 이 점 때문에, 배지가 이상한것이 아닐까 라는 생각을 했는데, 특정 세포를 배양할때 노란색을 띄는 배지를 사용하는 분이 계셨습니다. 그래서 이것도 들어가는 조성이 비슷한 부분이 있어 문제 없다고 판단을 했습니다. (따로 걱정되는 것이 있다면, MEM NEAA같은 경우 100X로 제품을 판매하였는데, 회사 기술정보를 통해, 제품의 농도가 10 mM인것을 확인하고 10배 희석하여 1 mM농도가 되도록 배지를 제조하였습니다. 혹시 기존 제품의 농도가 10 mM이 아니라서 이렇게 배지의 색이 노란색을 띄고, 그로인해 세포에 문제가 생긴것인지 고민해봤습니다. 이 부분에 대해 MEM NEAA가 많이 들어가게 되면, 혹은 적게 들어가게 되면 배지의 pH가 변하는것에 대해 아시는분이 계시다면 조언 부탁드립니다.)   세포 상태의 경우는 드라이 아이스로 배송되자 마자, 액체질소에 보관하였습니다. 혹시 처음부터 세포에 문제가 있었을 가능성도 생각해 보았지만, 현재 배송된지 1달이 흘러버렸고, 판매 업체에서 제공하는 handling protocol을 그대로 따라 하지 않았기 때문에(feeder cell 사용하지 않아야함) 품질 보증을 받을 수 없을것 같습니다.   현재는 세포를 푼지 하루가 지났고, 아직 세포가 부착되어 있지 않아, gelatin coating을 다시 진행하고, 세포를 그대로 새로운 배지로 이동시키려고 합니다. (몇몇 정보를 보았을때는, 세포가 이미 죽었을거라는 글을 보았고, 조금 더 기다려보라는 식의 글을 보았습니다.) 만약 세포를 이동시켰을때도 부착되지 않는다면, 새로 구매를 진행해야 할 것 같은데, 이후 같은 문제가 발생하지 않기 위해, 여러 정보를 알아보고 다시 준비하려고 합니다. 이 글을 읽고 조언 부탁드립니다.   감사합니다.  
회원작성글 백근영  |  07.20
Q. NK cell 배양 중인데 잘 크고 있는건지 봐주실 수 있으신가요~? 첨부파일
처음 NK 를 배양 해보고 있는 사람입니다.  Cell line 이 지금 맞는건지 잘 몰라서 현미경 사진 첨부합니다.  현 항CD16 코팅 처리한 T75 플라스크에 3일째 배양 중이고. IL-2 2000~3000 IU/ml 처리 하였습니다.   5일째 T175 플라스크로 계대 할 예정입니다.  계대하면서 IL-2, IL-15, 항CD56, 항NKp46, 항NKp30 을 배지 처리하여 하려고 합니다.  NK 세포는 따로 KIT 사용 없이 PBMC 해서 PBMC 층만 분리하여  NK 세포 자극제 투여로 배양 중 NK cell 양을 높이려고 합니다. 첨부 사진 봐주시고, 잘 크고 있는건지 피드 한번 부탁드립니다.  감사합니다.   
회원작성글 Derick  |  07.20
Q. C2C12 Cell culture 중 궁금한 것이 생겨 질문드립니다!
C2C12 Cell culture 중 현미경으로 관찰 하다보니 위처럼 비정상적인 형태가 관찰되어 질문 드립니다.  빈도가 잦지는 않지만 간혹가다 이런 형태가 보이는데 혹시 Contam. 인가요? 아니면 자연스러운 현상인지 궁금합니다.  Media는 DMEM(high) + 10% FBS + 1% PS 사용하고 있습니다.   
회원작성글 헤업미  |  07.20
Q. Hek293 계대 시간
3-4일 간격 즉 월요일 목요일 간격으로 하다가 목요일에 시간이 안맞는 일이생겨, 수요일 밤에 하려고 하는데, 괜찮을까요? 다음 계대는 월요일 9시입니다.
회원작성글 바닷가  |  07.19
Q. HS68 cell 모양이 이런이유는 뭐에요? 첨부파일
ㅊhs68 처음 키워보는데 미디어 갈아주려고 현미경으로봤는데 저렇게 모여있고 모양이 다른이유는 뭔가요? 교차오염인가요...? 군데군데 저렇게 뭉쳐있는데 상태가 많이 안좋은건가요? p.n는 24 입니다! 14일에 stock 풀고 다음날 미디어갈아준 후  오늘 미디어 갈았습니다. 미디어를 자주 안갈아줘서그런가요? 
회원작성글 leedayoung  |  07.19
Q. B16 F10세포 멜라닌 생성 저해 실험 sample blank관련 질문드립니다
더운 날씨에 연구하시느라 다들 수고가 많으십니다 ㅎㅎ B16 F10세포로 멜라닌 생성 저해실험 프로토콜을 만들고 있습니다 다른 cell실험의 경우 sample blank에 MTT시약을 넣지 않는다던가의 미처리 시약이 있는데 멜라닌 생성 저해 실험의 경우 sample blank에 처리하지 않는 시약이 무엇인지 모르겠습니다..   저의 경우 sample, cell과 a-MSH 처리 후 10% DMSO가 함유된 1N NaOH를 처리하는 것으로 알고 있는데 sample blank에 어떤 시약을 처리하지 않는 것인지 알려주실 수 있을까요 ?
회원작성글 도비에용  |  07.19
Q. 천연항생제 추출물
우리나라 항생제 과잉처방으로 인해 부작용 사례가 많이 일어나고 있다 다른 천연항생제로 대처해야 하는 이유를 알리는 목적으로 실험을 진행하는데 천연항생제 추출물을 흡수시킨 페이퍼디스크를 페트리 접시에 밀봉시킨 후에 하루 건조한 이후 세균 배지 위에 올려놓고 증류수 한 방울씩을 떨어뜨려 확산 결과에 따른 세균 억제 반응을 보는 실험이예요 현재 실험 진행 중인데 이번주 금요일 안에 끝내려고 해요..그런데 문제가 3가지가 있어요 첫 번째 , 미리 선생님께서 구매하신 배지를 잘 되나 확인하려고 미리 세균을 접종해봤는데요 ( 선생님이 지구과학선생님이셔서 생명관련 실험은 잘 모르신다고 하셨어요 ) 배양기에 돌려야 하지만 그때 배양기 사용법을 배우기 전이라 그냥 놓고 한 3일 지난 후 확인해봤는데 빨간 점이 여러개 올라왔더라고요.. 원래 미리 찾아봤을 때는 인터넷에서는 하얀 곰팡이 같은게 널게 올라오더라고요 그래야 실험 결과로 페이퍼 디스크에서 몇 지름에 세균억제 작용이 나왔는지도 알 수 있고요 이 세균 배지로 사용해도 될 까요 두 번째 추출물을 만들때 점심시간에 빨리 만들려고 했으나 종이 쳐서 미리 가루 10g과 에탄올 100ml를 섞어 놓고 파라필름을 씌운 다음 체육하고 나서 바로 다음 쉬는시간에 파라필름을 살짝 열어서 다시 섞고 파라필름 덮은 이후 냉장소에 넣어놨어요.. 바로 냉장실에 넣지 않았는데 괜찮을까요 심지어 파라필름을 가장자리부분을 살짝 떼었다가 다시 붙여서 잘 될 지 걱정되요 세 번째 , 선생님께서 항생제 과잉처방을 지적하는 문제를 배경으로 정했기 때문에 항생제로 추출물을 만들어서 대조 해보라고 하셔서 항생제 추출물 페니퍼 디스크는 어떻게 만들어야 하나요.. 참고로 실험은 3일 걸리더라고요 금요일에 방학식이라 그 전에 끝내야 해요 처음 실험을 혼자 진행해보는 거라 너무 막막하고 힘드네요.. 제발 도와주세요ㅠㅠ세특에 들어가는거라 잘 해야 합니다
회원작성글 블루로즈  |  07.19
Q. 물질의 석출현상을 해결할 수 있는 방법이 있나요?
안녕하세요! 현재 암세포에 물질을 처리해 항암효능을 확인하는 실험을 진행하고 있는 석사과정 학생입니다.  다름이 아니라 물질을 처리하였을 때, 석출현상이 발생하는데 이러한 석출 현상을 해결하는 방법을 아시는 분의 도움을 구하고 싶습니다.ㅠㅠ   석출현상을 해결하기 위해 votex, sonicator를 활용해 보았고 항온수조를 통해 온도를 조금 더 높이는 방법도 사용해 보았지만 석출현상이 계속 일어나고 있습니다ㅠㅠ
회원작성글 익명09  |  07.18
Q. C2C12 cell culture 중 무엇인지 궁금합니다.!
C2C12를 cell culture 중 이상한 형태가 관찰되었습니다. 6well 에서 100% 정도 키운 뒤 GM에서 DM으로 교체 후 약 5일이 지났을 때 cell의 사진인데 지금까지 한번도 보지 못한 형태라 질문합니다!
회원작성글 뉴트리아  |  07.18
Q. gardient PCR 결과 3개의 band가 나타납니다.
안녕하세요 석사과정 1년차 학생입니다.. 혼자 해결하려고 해도 방법이 없어서 도움 요청드립니다. gradient PCR 결과이구요 blast 결과 한가지 gene만 증폭이 가능한것을 확인했습니다. product size 157인것을 보면 위 결과사진에서 맨 아랫줄에 있는 밴드가 맞는 것 같은데, 위에 두 줄이 왜 나오는지 모르겠습니다.. 혹시 63도보다 더 높은온도까지 올려서 PCR을 해봐야 할까요?   다른 gene들 PCR에는 전혀 문제가 없어서, meterial 문제는 아닐 것 같습니다. 해결방안이 있을까요?
회원작성글 wnsl1201  |  07.18
Q. cell freezing media
안녕하세요 자주 쓰던 cell 말고 새로운 cell을 구입하여 많이 풀어두고 스탁을 잡을 예정인데요 그전 cell은 DMSO:FBS=1:9로 프리징 미디어를 만들어서 스탁을 잡았는데 셀 종류에 상관없이 위 조성대로 만들어서 스탁 잡아도 되는건가요?? protocol을 찾아보니까 freezing media를 팔긴 파는데 그냥 단순히 프리징 용도여서 혼용해도 되는지 여쭤봅니다.. 참고로 새로 풀 cell은 RPTEC/TERT1 OCT2 입니다. 선배한테 배워서 아는 평소 쓰던 셀 말고 처음 구매해봐서 어떻게 해야할지 여기에 조언 구해봅니다ㅜㅜ
회원작성글 두비두밥  |  07.18
Q. animal cell transfection에 걸리는 시간은 어느정도 인가요?
animal cell transfection에서 사용하는 reagent가 cell에 독성을 띄는 것 같아서 (transfection만 하면 추후 처리 과정에서 자꾸 cell이 죽네요) transfection이 끝난 후에 배지를 일반 성장배지로 갈아주려고 합니다. 근데 어느 타이밍에 배지를 갈아줘야할지 잘 모르겠습니다. 너무 일찍 배지를 갈아버리면 DNA가 잘 transfection되지 않을 것이고, 너무 천천히 갈아버리면 cell이 그전에 damage를 많이 받을 것 같아서요.   DNA+reagent를 cell이 깔린 dish에 처리하고, 몇 시간쯤 지나면 DNA가 cell 안으로 충분히 transfection 되었다고 생각하나요?   경험이 많으신 분들의 조언 부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 가우미  |  07.18
Q. 농도 배율 계산이요 ㅠㅠ
total 50ml media에    5mM로 stock 되어있는 A시약을 10uM로 넣어주려고 합니다.   계산한게 맞는지 확인좀 부탁드릴게요.   5mM은 10uM의 500배이므로,   total 50ml (50000ul)에 10uM로 넣으려면 5mM A시약을 1/500으로 계산해서 총 100ul를 넣어주는게 맞나요?ㅠ   너무 헷갈리네요 ㅠ
회원작성글 대학원생n  |  07.18
Q. 세포 배양 배지 오염 확인 좀 부탁드려요 첨부파일
원래 그러진 않았던 것 같은데 오늘 보니 배지에 사진과 같은 투명한? 결정체 같은 게 많이 보입니다. 결정 모양을 현미경으로 확인해보니 길쭉하게 생겼구요. 근데 그 주위에 미생물인지 동그란게 떠다니는데 이거 오염일까요?
회원작성글 초보연구  |  07.17
Q. coverslip cell culture 해보신 분들의 조언을 구합니다...
BAEC을 35π dish에 coverslip 깔고 배양해서 현미경으로 찍고 싶은데요. coverslip에 BAEC이 붙질 않아서 실험이 진행이 안되는 상황입니다. 처음에 35π+coverslip에 seeding을 하고 고대로 냅두면 coverslip 위에 부착돼서 자라긴 하나 transfection을 하거나, washing을 하는 과정에서 cell이 다 떨어져버립니다. starvation까지 해야하는 상황인데 그 전 과정에서 이미 cell들이 다 떨어져서 starvation까지는 가보지도 못했네요... 1M HCl로 coverslip을 coating하는 acid wash 방법도 해봤는데 큰 차이는 없었습니다 ㅠㅠ BAEC이나 coverslip에 잘 안붙는 cell들로 coverslip cell culture 성공하신 분 계신가요...? 조언 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ     제가 뭐라도 좀 해보려고 시도했던거를 적어보자면 최초 seeding 후 24시간 이후에 transfection을 하였는데, transfection 후 6시간정도까지는 잘 붙어서 자라는 것을 확인 했으나 O/N로 배양하고 다음날 보니 cell들이 다 떨어져 있었습니다. -> transfection때 사용되는 PEI 때문에 cell이 damage 받아 죽는 것 같아서 transfection 8시간 후에 기존 배지는 제거하고 정상적인 성장배지로 갈아주었습니다. -> 성장배지로 갈아준 뒤에 O/N로 배양하니까 cell들이 죽은 dish도 있었지만, 일부 dish는 계속 붙어서 자랐습니다. 그래서 다음 과정으로 starvation을 주려고 성장 배지 제거하고 washing 했더니 이번엔 washing 과정에서 cell이 다 떨어졌습니다. -> 위 과정을 처음부터 다시해서 transfection 후 성장배지로 갈아주고, cell들이 좀 더 자라고 안정화(?)될 때 까지 더 오래 배양한 뒤에, 지금 washing을 전보다 더 아주 조심스럽게 했는데 이번에도 cell들이 다 떨어졌네요. 그래서 현 상황이 일단 cell 떨어진 dish를 incubator에 넣어뒀긴 한데, 이번에도 진행이 어려울 것 같습니다...
회원작성글 가우미  |  07.15
Q. cell stock 만들때 75T 플라스크 세포 양
75T플라스크 꽉 채워서 키우면 6-700만셀 정도, 스탁으로 만들면 200만셀/ml 3개 나온다고 들었는데요.   75T 최대한 빽빽하게 키운 셀에 트립신 (0.05%) 3분 치고 10FBS/DMEM 10 ml에 풀어 1000 rpm 3 min 다운시켜서 보면 펠렛 두께가 너무 얇습니다. (세포주 은행에서 받은 스톡 160만셀 펠렛의 1/3정도?) 구글에서 찾은 사진에 설명 덧붙여서 올립니다. 어떻게 하면 셀 데미지 없이 많이 가라앉힐 수 있을까요? 조언 부탁드립니다.  
회원작성글 컬쳐룸도비  |  07.15
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이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
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