혈관이 많은 얇은 필름형태의 조직층을 분리해서 세포를 분리해서 배양을 하는데요. enzyme 처리 후 single cell로 분리된 세포들을 dish에 seeding 해서 1차 배양시엔 많은 세포들이 붙어서 자랐어요. subculture 하면 죽어나가는 세포도 있는데 막상 붙은 세포들이 더이상 자라지 않고 옆으로 퍼지기만 하네요. 적응 시간이 필요한가 해서 배지만 갈아주면서 오래 키워보기도 하고, 세포양이 적어서 그런가 싶어 작은 디쉬로 옮겨도 줘보고, 배지도 바꿔줘보고, 코팅도 해줘보고 하는데 수를 늘리기는 커녕 퍼지다가 죽는거 같아요. 계대를 하면 점점 수는 줄고, 실험을 진행할수가 없네요. 벌써 몇년째라 다른 실험 하면서 마치 취미생활하듯 가끔 생각날때마다 분리해보곤 하는데 여전히 반복되네요 ㅠㅠ 딱 첫 씨딩에서만 이쁜 모습으로 잘 자라는데 이걸 어찌 해결해야할까요. 차라리 조직양을 많이 해서 첫 씨딩때 세포를 많이 얻은 뒤에 한번에 실험을 진행해야할까요? 많은 세포들 사이에서 단일세포종도 분리 해야하는데 진행할수가 없네요 ㅠㅠ

6 well Cell wahsing Trypsin 200ul 5min  Media 1ml Cell down centrifuge 상층액 제거   DPBS 1ml 로 suspension 이후 Trypan blue로 희석해서 Hemocytometer로 Cell counting   빨간 부분이 제가 궁금한 부분입니다 Cell counting 시 DPBS로 Trypan blue 랑 섞어도 되나 싶어서요!    RNA 추출할거라 어떻게 해도 상관없는데 STEP을 좀 줄이고싶어요 media는 완전 제거가 필요해서 이렇게 해도 되나 싶어서요

제가 처음 HCnEpC(대장염 세포)를 다루는데 정해진 medium들이 있더라구요 그 중 defined culture medium이 있는데 상온으로 데우고 절대 37도로는 데워서는 안 된다고 되어있는데 이유가 뭔가요..? 그리고 thawing medium이라는 것이 따로 있는데 이전에 세포 배양을 할 때에는 medium을 37도로 모두 데운 뒤 사용했는데 세포 배양 설명서에 thawing medium에 대해서는 데우라는 말이 없어서 데우는 것이 맞는지 확신이 안 드네요ㅜㅜ 

세포 동결(stocking) 시 질문 있습니다. 제가 배웠을 때는, 세포 동결할 때 cryovial에 넣은 다음, container에서 24시간동안 freeze 후 질소탱크로 옮기라고 배웠는데 제가 동결하다가 그만 vial하고 e-tube와 헷갈려서 사진처럼 생긴 e-tube에 cell line을 동결하고 질소탱크로 옮겼습니다. 혹시, 이거 때문에 세포가 오염되거나 thawing할 때 잘 안자랄 수도 있나요? 만약에, 이게 문제가 된다면 thawing하고 나서 다시 vial에 옮겨줘야 하는지도 답변 주시면 감사하겠습니다. 

계속해서 이러한 contamination이 발생하는데 원인도 종류도 모르겠습니다 ㅠㅠ 제발 도와주세요ㅠㅠㅠ 배경 보면 이상한 점들?이 많이 생겨있는데 왜 생기는지 대체 뭘 해야할지...제발 도와주세요,,,,     HeLe cell 10% FBS DMEM (0.2 uM filtered)

안녕하세요.   다름이 아니라 얼마전에 다른 연구실에서 cell stock (atcc) 을 분양받아서 풀었는데 세포가 하나도 붙지 않았습니다.   원래 저희 연구실에서고 키우고 있던 세포라 배지 조건때문은 아닌것같은데   마음에 걸리는 점이  세포를 가져다 주실때 1시간 반거리인데 스티로폼 아이스박스에 아이스팩 3-4개 정도 넣어서 stock을 가져오셨더라구요.. 세포가 녹아 있진 않았습니다.   제가 알기론, 드라이아이스나 액체질소에 넣어 이동해야된다고 알고있는데 혹시 이것도 이유가 될수 있을까요..?

Horse Serum을 구입하려고 하는데요 Donor가 적어져 있는 serum과 안 적어진 serum의 차이는 무엇일까요? 그리고 custom serum도 있던데 혹시 어떤건지 알려주실 수 있을까요?   도와주세요!

안녕하세요, 저번에 hpeg2 세포가 정전기적 표면처리된 T25 Flask에서 잘 부착되지 않고 뭉치는 문제로 이 게시판에 질문을 남겼었습니다.   그래서 이번에 0.1 mg/ml 농도로 콜라겐을 T25 Flask에 코팅한 후에 세포를 thawing해 보았는데요, 괜찮은 건가요? 비교 사진을 첨부하였습니다. 참고로 사용한 미디어는  MEM 90% + 10 % FBS+ 1% P/S 입니다. 제가 보기에는 콜라겐 코팅 Flask에서 더 잘 부착되어 보이는데... 다른 분들이 보시기에는 어떠신가요 ㅜㅜ?  

안녕하세요 석사과정 2년차 대학원생 입니다ㅠㅠ 지금 3일째 hESC(human stem cell)을 풀었다가 다시 시도하는 것을  반복중입니다.... -80도 deepfreezer에 2017년도에 얼린 cell을 matrigel coating된 well에 풀었습니다.  근데 hESC들이 부착되지 않고 대부분 single colony가 되어  둥둥 떠다닙니다...  부착이 되지 않은 것인지, cell들이 다 죽어서 떠다니는 것인지ㅠㅠ 3일동안 너무 스트레스 받네요ㅠㅠㅠ   stem cell에 대해서 잘 아시는 분 계실까요?

현재 세포독성실험만 10번은 진행했는데 흡광도가 자꾸 0.7~1.3 정도로 나옵니다ㅠ L929셀을 96well plate에 1×10⁵개/well씩 깔고 다음날 검액 교체했습니다. 그리고 24시간 후에 EZ-cytox(WST assay) 10ul 처리해서 1시간 동안 CO2 incubator에 넣어뒀다가 흡광도 측정하는데요.. 사수분은 항상 흡광도가 0.9~1.1 사이로 나왔고 실험실 프로토콜 상으로도 그 정도 범위에 들어가는 흡광도로 나와야 하는데 저는 암만 해도 그 정도로 안나오네요ㅠ 몇 번이나 실험 말아먹는 중인데 어떻게 해야 흡광도값이 일정하게 나올까요ㅠㅠ

protoplast를 추출하고 hemocytometer로 계산하고 있습니다. 계산해야하는 샘플의 양이 많아서 현미경을 오래 보고 있기 힘들더라구요. 혹시 세포를 넣은 hemocytometer 사진을 찍고, 다른 프로그램으로 자동 계수하는 방법이 있을까요? Image J 나 기타 프로그램으로 할 수 있는 방법 알려주시면 감사하겠습니다!

cryo vial을 사용중인데, 동결 시 바이알을 꽉 잠그고 -80도에 보관 후, 액체질소(liquid nitrogen)로 옮깁니다. 동결 후 풀면 세포 상태가 너무 안좋고 붙어있는 셀 양도 별로 없어 질문남깁니다 ㅠㅠ  1. 동결을 풀기위해 액체질소에서 꺼내면 vial안에 액체질소가 들어서 부글부글 끓는 것이 보입니다. 정상인가요..? 그리고 꽉 닫았던 뚜껑들도 뚜껑이 얼어 다 헐렁헐렁해져서 살짝만 힘줘도 열려버립니다...  2. 안에 액체질소가 들어가더라도 세포는 사용이 가능한가요?? 액체질소에 닿으면 세포에 타격이 가나요.. 3. 안에 들어간 액체질소를 빼주고 사용해도 된다면, 뚜껑을 열지않고 엎드리기만해도 액체질소가 빠져나오던데 이렇게 빼주면되나요 아니면 꺼내자마자 뚜껑을 살짝 열어 빼주면 되나요..?   * 저는 액체질소에서 빼내서 실험실로 가져가 바로 37도에 녹입니다. 닫힌상태에서도 증발이 된다면 녹이는 과정이나 들고옮기는 과정에서 다 날라가지않나요..?? 근데도 세포가 이상해서 ㅠㅠㅠ 

vero/h 가지고 실험해보는 학생입니다.  6well 96well 에 각각 깔아 plaque assay를 할려고 하는데  6well에는 4x10^5  96well에는 1.5x10^4 으로 well당 깔라고 알려주셨는데 cell counting해보니 1ml당 3.5x10^6이 나왔습니다 DMEM을 섞어 농도를 맞춰주는데 각각 몇씩 추가해주어야 알맞은 농도가 나올까요?.. 계산하는 법도 알려주시면 감사합니다..   초보적인 질문이라 죄송해요 ㅠㅠ

안녕하세요. 인간유래 피부세포로 세포 증식활성 실험중입니다. 보통 Cell counting kit-8로 세포 증식능 데이터를 내는데 대조군과 비교가능한 사진도 같이 찍습니다. 사용하는 현미경은 일반 세포 관찰용 현미경인데 배율에 따라 사진도 잘찍힙니다. 문제는 세포가 좀 더 또렷하게 보이게끔 세포를 염색시켜서 사진을 찍으려고 하는데 이 때 사용할수있는 세포 염색약이 있을까요? 찾아보니 trypan blue로 동물세포 염색을 한다는데 이 염색약은 죽은세포를 염색시킨다고 하더라구요 형광은 사용이 안되어서 형광을 제외한 세포 염색법이 있으면 알려주시면 감사하겠습니다 아래처럼 세포 사진을 찍을수있는 방법은 무엇인지 알수있을까요?

cell line은 HaCaT 이고, 1XPBS로 washing 후, media(DMEM) change 직후 사진입니다. RNA isolation 을 진행하기 위해 12-well plate에 seeding 해 둔 상황인데, media change 하기 직전까지는 괜찮았던 cell이 저렇게 되니 당황스럽네요ㅠㅠ 왼쪽 부분이 제가 평소에 아는 HaCaT morphology이고, 오른쪽 부분은 마치 cell이 터진 것처럼 물방울이 cell 주위에 형성된 저는 처음 보는 비정상적인 모습입니다. 혹시 이런 비슷한 경우를 경험하신 분이 있나요? 있으시다면 원인이 무엇인가요?ㅠㅠ 나름 HaCaT cell culture를 컨탐 없이 해왔어서, 원인을 정확히 모르겠습니다ㅠ

한국세포주은행에서 세포주를 검색하면 passage number까지 알 수 있다고 들었는데 culture method와 culture morphology까지만 보입니다.. 미천한 학부생에게 가르침을 주십시오

안녕하세요.    cell stock 배지로 이번에 처음 Gibco 사의 Cell freezing medium을 구입하였습니다. (Cat# 12648010)   이전에 lonza 회사꺼를 썼는데 단종되서.. 바꿔보았는데요.    이전 사용했던 것과는 다르게 이건 보관온도가 -20도 이고 사용할 때 4도에서 thawing하여 사용하라고 하더라구요.   그런데 할 때마다 녹이기 번거로울것 같아서 혹시 4도에 계속 보관해도 되는지 질문드립니다. 

안녕하세요. cell 실험을 하는 학생입니다. 현재 cell을 계속 키우고 있는 상태 (stock으로부터 계대는 2번 한 상태) 입니다. 제가 궁금한점은. (seeding할 용도) 100파이의 한 플레이트를 12개정도로 divide해도 상관 없는건가요? (passage num을 낮추기 위해서요) 또 stock으로부터 꺼내진 cell을 몇번 정도 계대를 해주어야 seeding 이 가능한건지 알고싶습니다

계대 후 cell stock을 하려고 하는데 어느정도 cell이 차야 stock하는게 좋나요? cell들은 다 붙었는데 아직 뜨문뜨문해보입니다. 지난번 계대에서는 꽉 채울 때까지 있다가 계대한건데 꽉 채워야 stock하기도 좋나요?  또 이번에는 penicilin을 첨가한 media로 배양하였는데 그럼 기준이 또 달라질까요? 답해주시는 선생님들 항상 감사합니다. 

학부생입니다. ㅜㅜ오늘 교수님이 세포 해동 하시는걸 보여주셨는데, 너무 훅 지나가서 스스로 정리 해봤습니다. 이상하거나 틀린 부분이 있나요? 1. HaCa T 8&9 cell을 tank에서 꺼낸다 2. water bath에 packing이 물에 잠기지 않게 cell을 녹여준다 3. media 소분 해주기50ml 4. HaCa T세포 와 media를 15ml 튜브에 1:3 or 1:4로 넣는다 - cell stock 안에 보존액과 불순물을 washing 하기 위해 (배지 만들기)DMEM 에 fbs 10퍼 항생제 1퍼 45:5:0.5 4. 세포를 푼 15ml 튜브를 centrifuge 돌린다. 1분 1500rpm 5. 그동안 배양할 dish에 해동날자와 세포이름 계대횟수를 적어준다. 6. 15ml 튜브를 suction 하여 cell만 남긴다.(거품부터제거한다) 7. pellet에 media를 넣어 섞어준다. 8. dish에 9ml media 를 넣는다 9. 7에서 섞은 cell들을 1ml dish에 옮긴다 10. 뚜껑에 튀지않게 잘 섞어준다