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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 카테고리: 전체 > Immunology
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. IHC/IF 분석법
IHC 또는 IF 관련하여 제가 말한 시험법이 가능한지 고수분들 답변 부탁드립니다 일단 목적은 항체-his tag 시료가 종양 조직 내부에 penetration했는지 확인하기 위함입니다. 1. 종양 xenograft model mice에 항체-his tag 시료를 정맥 또는 IP 주사 2. 시간별로 종양 조직을 고정하여 section 3. 항체-his tag를 capture하기 위해 his-tag-형광 항체 반응 --> confocal 확인 또는 3-1 항체 his tag를 capture하기 위해 his tag 항체 반응(primary) --> his tag 항체와 결합하는 secondary-HRP 항체 반응 --> DAB 반응 --> 현미경 확인 이렇게 진행하려고 하는데,  종양 조직에 penetration된 항체 detection을 일반 confocal 또는 ELISA 보듯이 하려고 하는데.... 될까 모르겠습니다...ㅠㅠ 혹시 해보신 적 있으신 분들 경험 공유좀 부탁드립니다!!
회원작성글 cjdmadldi  |  06.07
Q. transfection 할때 chemical 처리
보통 transfection하고 난 뒤에 media change를 해줄 때 chemical을 처리하나요? chemical 을 먼저처리하고 transfection을 하나요
회원작성글 연근싫다  |  06.06
Q. Microplate reader(Molecular device, #versamax)로 ELISA 측정할 때 blank 설정?
안녕하세요. 초보 대학원생입니다.  간단한 내용이지만 Search를 하지 못하여 질문드립니다ㅠㅠ   Microplate reader (Molecular device, #versamax)로 ELISA를 측정하고 있는데요.  기계로 측정할 때 blank 설정을 하는 방법에 있어서 궁금한 것이 있습니다.    아무것도 안들어 있는 well을 blank로 설정하는 것이 맞는건지, Standard curve에서 0ng/ml의 농도를 blank로 설정하는 것이 맞는 건지 모르겠네요.. 제가 같은 Plate에서 ELISA시 여러 조건들을 실험하기 때문에, Standard curve에서 0ng/ml의 농도를 blank로 설정하게 되면 -값이 뜨는 곳도 있어서 보통 이런 경우에는 blank를 어떻게 설정을 하시는지 궁금합니다.   
회원작성글 버들  |  06.03
Q. 항체 너무 비싸요.. 여기서 중고거래? 해보신 분 있으신가요..
안녕하세요 9월 입학 예정으로 미리 일하고 있는 인턴입니다! 신생랩이라.. 인턴인데도 가르침 받지 못하고 강하게 크고 있어요ㅠ   항체는 왜 이렇게 고가의 실험재료일까요... 혹시 여기서 항체 소분해서 맞교환 하셨다던가  저렴하게 판매하는거 보신 분 있으실까요?ㅠㅠ 넘나 비쌈.. 진짜....   M1, M2 macrophage marker (IL-6 등) 위주로 찾고 있습니다..
회원작성글 빵빵  |  05.31
Q. 2차 항체 질문입니다.
안녕하세요. 다른 전공을 하다 면역학에 뜻이 생겨 들어왔는데, 나름 공부하고 찾아보고 해도 해결되지 않는 궁금증들이 너무 많습니다. 도와주세요!   human sample에서) 1차 항체로 mouse anti-human, rabbit anti-human을 같이 붙였을 때, 2차 항체로 goat anti-mouse, goat anti-rabbit을 같이 써도 되나요? 아니면 2차 항체의 host도 다른 것으로 쓰는게 좋나요? 이유가 있을까요?   mouse sample에서) 1차 항체로 mouse anti-CD를 붙이고, 2차 항체로 goat anti-mouse를 써도 되나요? 1차 항체는 monoclonal이니 mouse sample에다가 mouse 유래 항체를 붙여도 될 것 같은데, 2차 항체는 polyclonal이니까 anti-mouse를 쓰면 sample도 잡아버릴 수 있지 않을까 걱정이 됩니다. 이는 실험을 해봐야 아는 것일까요? 만약 background가 안 잡히면, 이는 논문에 써도 되는 항체일까요?   감사합니다.
회원작성글 근육연구원  |  05.31
Q. 단백질 정량 결과 단백질양이 너무 적은데 western blot 못하겠죠...? ㅜㅜ
안녕하세요,, 제목 그대로 BCA나 Bradford assay 통해서 단백질 정량했는데 너무 양이 적더라구요,,  Gel에 sample loading할 때 well 당 최소 10~ 최대 30 ug의 양은 들어가야 한다고 알고 있는데 최소 10uL씩 분주할 때 well하나에 10ug씩은 턱없이 부족합니다.. 그러니까 한 well에 10 ug/10uL 로 분주하려면 1000 ug/ml의 농도인데 sample buffer와 1:1로 혼합하니까 결국 2000 ug/ml의 단백질은 필요한거 잖아요? 그런데 bradford로 정량하니까 대략 850~890 ug/ml 정도밖에 없더라구요..  이럴때 보통 어떻게 하시나요...? cell 농도를 높여서 seeding 후 회수하시나요..? 저는 permeability test 후 cell을 회수하는거라 cell회수에 최소 한달은 걸리는데 너무 암담합니다..  
회원작성글 experiment  |  05.30
Q. Cryosection (frozen section) 도와주세요 첨부파일
안녕하세요 Starflower입니다. Cryosection이 잘 안되서 이렇게 질문드립니다. Mouse whole brain을 coronal 방향으로 section 하려합니다. 오늘 사용한 sample의 경우 제가 만든 sample은 아니지만 PBS, 4%PFA로 관류 후 30% sucrose에 두고 가라앉힌 다음 드라이아이스에 에탄올을 넣고 oct compound로 굳혀 만든 sample로 알고 있습니다. 그리고는 -80도에서 보관하고 있었고, cryostat에서 1시간정도 두어 온도를 맞춰줬습니다. mold가 너무 커서 면도칼을 이용해서 주변 oct 정리 좀 한 뒤 section을 하니까 문제가 발생 했습니다. 문제는 크게 4가지 입니다. 1. 조직과 함께 oct가 계속 말립니다. 2. 절삭할 때 쭈글쭈글하게 나옵니다. 3. oct와 함께 붙어 나오지 않고 조직과 분리됩니다. 4. slide glass에 붙일 때 bubble이 너무 많이 들어갑니다. 바로 slide glass에 붙이는 방식으로 하려는데 이러한 문제들이 있습니다. 어떻게 하면 고칠 수 있을까요
회원작성글 Starflower  |  05.30
Q. 방울 토마토, 감염이 일어나질 않습니다.. 도와주세요.. (Xanthomonas perforans)
 안녕하세요 고등학교에 재학 중인 학생입니다. 학교에서 전신획득저항성(SAR) 관련 실험을 진행하고 있는데 한가지 큰 차질이 생겨 질문 남기게 되었습니다.  SAR 유도 물질로서 알려진 살리실산을 처리한 뒤(無, 0.5mM, 1.0mM) 방울 토마토 모종에 Xanthomonas perforans을 처리하였는데요, 현재 10일 가량 지난 시점에서도 감염 부위가 전혀 보이질 않습니다.  세균 처리 전, 현탁액의 CFU를 측정하고 처리하려 했으나 시간 관계상, 목적상(감염) 크게 중요하지 않을 것 같아 건너뛰어 대략적인 농도는 말씀 드리기 어려울 것 같습니다.  첫 처리 땐 백금이로 고체 배지에서 5번 긁은 만큼 200mL 증류수에 넣어 분무기로 5회 엽면 처리하였고, 이후 5일 뒤에는 1번/200mL, 10번/200mL의 두개의 현탁액을 만들어 분무기로 5회 엽면 처리, 스포이트로 2.5mL 엽면 처리, 5mL 관주 처리(토양)에 했습니다.  뒤늦었지만 세균 처리한 논문을 여러개 찾아보았고, 본 실험과 습도, 온도, 처리 방법에 차이가 있다는걸 알게되었습니다.  내일인 월요일에는 0.9% NaCl 용액, 증류수를 각각 200mL씩 사용하여 처리한 후, 비닐 랩으로 간이 온실을 만들어 가습기와 전등을 함께 비치할 생각입니다.  위 실험 과정의 어떠한 문제점 때문에 감염이 일어나지 않는지 알고 계시다면.. 피드백을 간곡히 부탁드립니다.. ㅠㅜ
회원작성글 인냥  |  05.30
Q. RAW264.7 cell로 TNF-alpha 측정했는데 흡광도가 너무 높게 찍힙니다..
  안녕하세요. 면역실험을 배우고 있는 예비대학원생입니다.   이제껏 RAW264.7 cell로 NO assay만 해봤는데, NO assay 하기 위해 100 ul를 가져올때 추가적으로 50 ul를 더 가져와서 TNF-alpha elisa kit로 처음 실험을 해보았습니다. 실험은 동봉된 프로토콜대로 진행을 했으며 450nm - 620 nm 흡광도 값으로 계산을 하려고 합니다. standard curve를 그려보니 standard에는 문제가 없고 kit에 포함된 mouse TNF-alpha control도 범위 내인 0.7 정도로 나와 측정이 잘 되었다고 생각이 됩니다. 그래서 kit의 문제는 아닌 것으로 생각이 되는데 제가 측정하고 싶은 추출물 값이 대부분 3.6 이상으로 너무 높게 측정이 되었습니다.... LPS를 처리하지 않은 건 흡광도가 0.15이며,  LPS 처리한 상층액은 3.7, 제가 positive control로 쓴 L-NAME과 농도별로 처리한 추출물도 마찬가지로 3.7 정도로 높게 측정이 되었습니다. NO assay에는 농도의존적으로 감소하는 결과를 보였는데 같은 상층액으로 실험을 해도 왜 TNF-alpha에서는 줄어들지가 않는지 궁금합니다....   추가적으로 제가 찾아보니 https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=32081&ksr=1&FindText=TNF-alpha,%20RAW264.7 글에서 겨우살이님께서 phenol red가 없는 배지를 사용했다면 가능하다고 적으셨는데 이게 혹시 문제가 될까요...? 아무래도 kit가 비싸다보니 자주 실험하기엔 저도 부담스럽고 최대한 빨리 이유를 알아서 재실험을 해보고 싶은데 지금 알고 있는 지식으로는 한계가 느껴집니다ㅠㅠㅠ   잘 아시는 분들 계시면 도움 부탁드립니다!
회원작성글 예비대학원생s  |  05.29
Q. astrocyte, microglia
astrocyte 또는 microglia 같이, 뇌와 관련된 신경 또는 면역세포 연구에 관심 있는 석사생입니다. 질문은 다음과 같습니다. 1)astrocyte, microglia cell들은 굉장히 예민하여, culture 자체가 어렵다고 들었습니다. self activation이 일어나고, contaim에 예민하다는데... 다음과 같은 특징들이 왜 culture를 할때 힘든건지, 추가적으로 위의 cell들의 특이사항들을 알고 싶습니다.   2)astrocyte와 microglia cell line 추가적으로 marker들을 알고 싶습니다. 현재 정보 수집 중에 있는데 찾는게 쉽지 않네요 ㅠㅠ 3)위의 cell들 외에 뇌와 관련된, 실험에 용의한 cell이 있다면 추천 부탁드립니다. 저는 운동에 따른 위 cell들의 변화와 관련된 연구를 계획 중 입니다. 석사 신입생이라 아직 많이 부족합니다. astrocyte, microglia와 관련된 어떠한 조언이든 감사히 듣겠습니다! 
회원작성글 척척석사_  |  05.28
Q. macrophage therapy 관련 질문드립니다.
안녕하세요. macrophage therapy에 관심이 있어 질문드립니다. 1. 사람을 기준으로, 혈액에서 macrophage를 분리하고 배양하여 다시 주입 시 GVHD가 나타날까요? (autologous) 2. 사람을 기준으로, THP-1(human monocyte cell line)을 주입하면 GVHD가 나타날까요? 3. 사람을 기준으로, Raw264.7(mouse macrophage cell line)을 주입하면 GVHD가 나타날까요? 4. 쥐를 기준으로, THP-1이나 사람 혈액에서 분리한 macrophage를 주입하면 GVHD가 나타날까요? (vein injection 기준으로 여쭤봅니다) 논문들을 찾아봐도, 어떤 논문은 그렇다, 어떤 논문은 아니다 라고 상이한 내용이 있어, 경험이 있으신 선생님께 부탁드리겠습니다. 간단하게 네, 아니요 라고만 해주셔도 감사하겠습니다.
회원작성글 모자  |  05.23
Q. IP 후에 왜 Western blot으로 확인을 하는건가요?
학부생인데 궁금증이 생겨서 질문 드립니다 왜 면역침강후에 western blot을 하는지 이유가 궁금합니다  구글링을 해도 그냥 ip후에 동정을 위해 western blot을 사용한다고 하는데 구체적인 이유가 궁금합니다   
회원작성글 숨썬  |  05.22
Q. Confocal dish 사용법을 모르겠어요
안녕하세요 세포를 Confocal dish에 배양을 해서 Confocal을 찍으려고 합니다. 논문에서 Protocol을 보고 배우는 중인데 Confocal dish를 사용하면 coverslip으로 안덮고 찍으면 되는건가요??? PFA로 고정 후 DAPI 처리 후 그냥 찍으면 되는건가요??
회원작성글 쩝쩝석사과정  |  05.20
Q. protein solubility test
안녕하세요 최근에 solubility test로 단백질의 folding과 inclusion body에 관해 공부중입니다. 대장균에서 발현하는 단백질이 soluble한가 insoluble한가를 연구중인데 이 단백질이 나중에 항원으로 쓰이려면 왜 soluble해야 한가요? folding 때문이라고만 생각되는데 정확하게 solubility test를 하는 이유를 모르겠어요...
회원작성글 보노보노95  |  05.19
Q. elisa standard 흡광도에 튀는 값이 있습니다ㅠㅠ
안녕하세요.   cusabio의 chicken Estradiol ELISA Kit를 이용하여 competitive elisa를 진행하였는데 결과에 이상이 있어 문의드립니다.   standard 0~5까지 각각의 농도가 0, 40, 100, 200, 400, 1000이라고 명시되어 있습니다.   그런데 흡광도 측정 결과가 0 ->5의 순서대로 커지는 것이 아니라 중간에 튀는 값이 있습니다.   실험에 오류가 있나싶어 다시 진행해보아도 똑같습니다.   흡광도 결과는  첫번째 했을 때 s0: 2.467 / s1: 1.538 / s2: 1.137 / s3: 0.846 / s4: 1.124 / s5: 0.648 두번째 했을 때 s0:1.541 / s1: 1.468 / s2: 1.461 / s3: 1.204 / s4: 1.288 / s5: 0.771 입니다.   1. 이와 같이 다른 standard는 값이 그나마 괜찮은 듯 싶은데 s4값만 유독 튑니다. 이유가 무엇일까요?   2. 키트를 보니 expiration date이 지났던데 그래서 그런 걸까요? 똑같은 회사의 다른 키트(progesterone, testosterone)도 기한이 지났지만 standard 결과는 특이점이 없었습니다ㅠㅠ   3. 이렇게 튀는 값을 포함하는 standard를 이용해 샘플의 농도를 측정해도 유효한 결과라고 볼 수 있을까요?   아직 실험이 익숙치 않아 피펫팅에 오류가 커서 전부 1차로 딸깍 소리가 날 때까지만 로딩했습니다.
회원작성글 notorious..  |  05.18
Q. Antibody 작용원리 질문
면역세포를 stimulation하는 antibody가 있고 Depletion하는 antibody가 있는데 무슨차이인가요?? 예를들어 t cell을 culture하는데 anti cd3가 발려있는 culture plate를 사용합니다 이경우 t cell stimulation용이라 하더군요 그런데 in vivo 상에서 nk를 depletion할때 anti-nk1.1을 사용한답니다 그렇다면 어떤때는 stimulation이고 어떤때는 depletion인가요 Anti nk1.1이 발린 culture plate에서 nk cell을 키우면 다 죽는다는건가요 stimulation된다는 건가요 각각의 작용원리가 다른듯한데 구조상 차이가 있는걸까요 어떤 원리의 차이에 의함인지 궁금합니다
회원작성글 Damien  |  05.18
Q. RPR 과 VDRL 실험 차이
두가지 실험 모두 매독을 검사하는 실험인데 왜  VDRL만 보체를 불활성화 시키는 과정이 필요한지 궁금합니다!!  
회원작성글 해성이  |  05.17
Q. FACS antibody staining
FACS antibody staining 과정에서 dead cell staining을 먼저 한 뒤 surface staining을 하고 나서 fixation, intracellular staining을 하는 것으로 알고 있습니다. 그런데 왜 순서를 꼭 이렇게 해야하는 건가요??
회원작성글 나의라임오렌지나무  |  05.13
Q. IHC-P dab 염색 질문 첨부파일
파라핀 섹션으로 dab staining 을 하는데요~ 첨부사진과 같이 얼룩이 나타나는 현상이 있습니다. 처음에는 signal 인줄 알았는데, control tumor 조직이나 약물처리 tumor 조직이나 antigen retrieval 을 하나 안 하나 안티바디의 종류에 상관없이 무작위로 나타났다가 없다가 하더라구요.  wash 문제같기도 한데 똑같은 날 똑같은 tissue, 똑같은 protocol 로 염색을 해보면 2장중에 1장은 저런게 나타나는 경우가 자주 있습니다. 혹시 이유를 아시거나 이 문제를 해결하기 위해서 조언을 부탁드리겠습니다. 저만 이런 상황을 겪은건지도 궁금하네요
회원작성글 철철대왕  |  05.12
Q. competitive elisa standard absorbance으로 엑셀 standard curve 및 샘플 농도 계산
안녕하세요.   competitive elisa kit를 이용하여 실험한 결과,  standard의 농도는 0, 0.15, 1, 5, 20, 70입니다. 흡광도는 1.050, 0.825, 0.598, 0.336, 0.219, 0.130입니다. kit 설명서에는 4-PL curve fit으로 그리던지 y축의 농도에 대해 x축의 각 standard 흡광도를 표시하여 그리라고 합니다. 데이터는 농도의 log versus 흡광도의 log를 표시함으로써 선형화될 수 있다고 합니다.   1. standard의 흡광도와 농도를 이용하여 엑셀에서 그래프를 그릴 때 지수, 선형, 로그, 다항식 중 어떤 것으로 그려야 할까요? 만약 로그로 해야 한다면 흡광도와 농도를 모두 로그형태로 바꾼 후 그려야 하나요?   2. 흡광도와 농도를 로그값으로 변경하니 대부분 샘플의 값이 음수로 바뀌고, 다항식(4차 또는 5차)로 그리면 농도 값이 터무니없이 커지거나 작아집니다..이유가 무엇일까요?   3. 유튜브에서 competitive elisa 그래프를 그릴 때 1/흡광도로 변경해서 엑셀로 그래프를 그리던데 이 방법이 맞는 건가요?  혹시 맞다면 이렇게 바꿔주는 이유는 무엇인가요?   4. 원래 reader기에서 흡광도 측정 후 농도까지 계산해주는 기계인데 실수로 인해 standard의 농도값을 잘못 입력하였습니다. 이 경우 샘플의 농도를 계산하려면 어떻게 해야할까요?   5. 마지막으로 sigmaplot 14.5를 이용하여 standard 흡광도와 농도 및 샘플의 흡광도를 통해 샘플의 농도를 구할 수 있나요? 매뉴얼을 찾아보아도 어떻게 구해야 하는지 감이 잡히지 않습니다ㅠㅠ   많은 답변 부탁드립니다..
회원작성글 notorious..  |  05.12
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