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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
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Buffer/Reagent Bioethics Etc.
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Q. ammonium sulfate precipitation후 dialysis
세포 밖으로 분비되는 protein을 회수하기 위해서 실험중입니다. centricon 제품으로 하려니 600ml를 다 농축시키는데 있어 너무 많은 시간이 들어서 방법을 고민중인데요, ammonium sulfate로 단백질을 침전시키고 centrifuge해서 얻은 단백질 pellet을 적절한 buffer로 resuspension해주고 그 sample을 centricon(저는 vivaspin을 사용했습니다)으로 내려 dialysis 효과를 볼 수 있을까요? 이전에 해본 바로는 단백질이 침전되고 buffer로 resuspension해줘도 밑에 가라앉는게 생기던데.. 600ml까진 아니라도 조금 더 볼륨을 높여서 buffer로 녹여주면 centricon으로 dialysis가 가능할까요? 아니면 녹지 않더라도 dialysis를 할 수 있을까요? ㅠㅠ secreted protein연구 쉽지 않네요..
회원작성글 ziw  |  2021.09.02
Q. 식물 단백질 추출
안녕하세요 선배님들   식품공학과 2학기에 재학중인 대학원생입니다.   다름이 아니라 제가 대두박 같은 식물체에서 단백질을 추출하기 위한 실험을 계획중에 있습니다.   단백질 추출에는 효소적/화학적/물리적 등 다양한 추출방법이 존재하더라고요.    그런데 다름이 아니라 알칼리나 산 용액으로 단백질을 용출시킨 후 등전점을 조절하여서 침전을 시키더라구요.   여기서 제가 기본상식이 부족한건지... 아니면 제가 못찾은거지는 모르겠는데, 기초적으로 왜 식물체에 알칼리 용액등을 이용하여서 추출을 유도할때, 어떤 원리로 단백질이 식물체에서 용출이 되는지를 파악을 못하겠더라구요...   혹시 관련된 논문이나 지식을 가지고 계신다면 가르침을 주시면 감사하겠습니다..    
회원작성글 훈찔  |  2021.08.25
Q. Protein 보관 시 -20도 괜찮나요?
SDS-Page를 위해서 Protein을 뽑고 나서  1. loading sample을 만든 후 95도에서 boiling후에 -20도에 보관을 하는데요, 이게 문제가 될 수 있나요?   2. Protein extraction sample은 반드시 -80도에 보관해야하나요? (RIPA buffer + Protease inhibitor 들어가있는 상태,) -20도에 보관했다가 BCA후 sample을 만드는데 시간이 지난 sample들이 웨스턴 결과에서 안보여서요...  
회원작성글 인문에서이학살아남기  |  2021.08.23
Q. protein extraction buffer 어떤 성분이 빠져야 할까요..? [activity test]
- 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 - 150 mM NaCl - 1% NP-40 - 0.5% DOC (deoxycholic acid) - 0.1% SDS - 1 mM PMSF   Extraction된 protein을 가지고 activity test를 하려고 합니다. 이런 buffer를 사용하면.. Enzyme이 activity를 유지하고 있을까요? 빼야한다면 어떤 성분이 빠져야할까요..?
회원작성글 이드  |  2021.08.05
Q. vivaspin 사용시 dialysis
vivaspin을 사용해서 상등액에 존재하는 단백질 농축을 하려는데요, 이걸로 농축해주고 나서 dialysis를 해야하나요? 그런 이야기를 들은 것 같아서요 ㅠㅠ 상등액 농축을 끝낸 뒤에 buffer로 교환하는 과정은 당연히 해야하는거 맞죠? 처음 써보는데 주변에 쓴 사람이 없어서 조언을 구합니다 ㅠㅠ
회원작성글 ziw  |  2021.08.04
Q. 세포주 COS1과 COS7의 차이가 무엇일까요?
HEP2는 후두의 표피양암종 세포인 것은 확실하게 나타나는데 두개의 정의와 차이가 확실하지 않네요ㅠㅠ 세포주 COS1과 COS7의 차이가 무엇일까요?
회원작성글 예뿌니  |  2021.07.31
Q. NP-40으로 핵막이 깨질 수 있나요?
안녕하세요! 석사 1차를 fractionation으로 보낸 대학원생입니다,,, 세포질과 핵막 분리 버퍼를 직접 만들어 사용하는 중인데요 두 단백질 분리가 잘 안됩니다ㅠㅠ여러 논문과 브릭을 참고하여 buffer를 새로 만들고 프로토콜도 수정해보았는데 문득 NP-40때문에 핵막이 깨지는건 아닌가 의문이 듭니다. 우선 버퍼의 조성은 아래와 같습니다. buffer A 10mM HEPES (pH 7.9) 10mM KCl 1.5mM MgCl2 0.1mM EDTA 1mM DTT 0.5mM PMSF (in isopropanol) 0.5% TritonX-100 0.5% NP-40   buffer B 20mM HEPES (pH 7.9) 0.4M NaCl 1.5mM MgCl2 1mM EDTA 1mM DTT 1mM PMSF (in isopropanol) 10% glycerol   과정은 간단하게 설명하자면 buffer A를 넣고 ice에서 20분 뒤 14000rpm에서 5분, buffer B를 넣고 ice에서 40분(10분마다 vortexing) 뒤 16000rpm에서 10분 입니다.   NP-40은 핵막을 깰 수 없을정도로 약한 detergent라고 알고있습니다. 근데 여기서 buffer A를 넣고 너무 오래 놔두어서 핵막까지 깨지는것일까요?? NP-40의 농도가 높거나 반응 시간을 높히면 핵막까지 깨질 수 있나요?   아래 사진은 부끄러운 제 western 결과 입니다,,,cytoplams에서 Histone이 많이 검출되는걸 보여드리려고 첨부합니다ㅠㅠ
회원작성글 신짜오  |  2021.07.30
Q. 단백질 필터
ammonium sulfate로 침전시켜서 펠렛 얻은 뒤 균을 걸러내기 위해 필터를 내리려는데 그랗게 해도 단백질에 문제가 생기진 않을까요?? 저번에 했을땐 뿌옇던 샘플이 투명해지던데.. 활성 태스트햇을때 비슷하게 나오긴 했습니다..!!
회원작성글 ziw  |  2021.07.30
Q. Western
단백질 추출후 Protein정량 시, 농도가 너무 높아서 Lysis buffer를 더 넣어줬는데 Centrifuge 해야 하나요,,,? 그래서 또 상층액 따서 정량해야 하나요,,,??
회원작성글 나다니95  |  2021.07.26
Q. 여러 개의 tag ( 6xHis, thrombin, T7 tag) 사용 시 문제점
pET-28(a+) vector에 유전자를 형질도입 시켜 사용하려 하는데 RBS앞에 6xHis, thrombin, T7 tag이 있습니다. 그 뒤엔 MCS자리가 있고요, 저희 실험실에선 6xHis를 사용하여 단백질 정제를 하고 있습니다. 혹시 여러개의 tag가 정제 시 문제가 되는 지 궁금합니다. 만약 문제가 된다면 제거를 해야할까요?
회원작성글 agaz  |  2021.07.26
Q. 진공 채혈튜브 Roller mix 하면 혈액 색상이 밝게 변하는 이유
진공 채혈관에 채혈 직후에는 혈액이 검붉은 색이었다가 Roller mix를 20분간 돌리면 밝은 색으로 변하는 이유가 무엇인가요 ? Tube는 BD K2EDTA vaccutainer를 사용하고 있습니다.
회원작성글 orange1537  |  2021.07.19
Q. 효소 희석
  안녕하세요.. 이분야가 아니라서 질문올립니다.   Glucose enzyme을 120 unit/mg를 0.1U/ml로 희석하려하는데 어떻게 해야하나요??   감사합니다..
회원작성글 우잉  |  2021.07.06
Q. Tris-HCl Buffer 문의
안녕하세요 콜라겐을 트립신으로 분해하여 LC/MS로 분석하려고 하는데 버퍼용액이라는 것을 처음 들어보았습니다.. (비전공자) 100mM Tris-HCl/1mM CaCl2 (pH7.6) 용액이 의미하는 바가 무엇인지 잘 모르겠어서 질문 올립니다.   1L를 제조한다고 할때, 제조 순서가 어떻게 되는건지 알려주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠ
회원작성글 닁닁스  |  2021.06.23
Q. 추출 실험전 고체시료를 증류수와 섞는 이유
곡물가루에서 단백질 추출하는 실험을 하고자 하는데, 주로 1000ml의 증류수의 50g을 섞으라 하더라구요.. 추출하여 원심분리 돌린 침전물이 50g/50ml를 넘어야하는데 50g보다 더 섞어서 실험을 진행해도 괜찮을까요???
회원작성글 쥬해  |  2021.06.18
Q. 천연물을 물에 녹여야 되는데 DMSO로 녹여 실험을 진행했습니다.
beta-d-glucan from barley 물질을 DMSO에 녹여서 실험을 진행했는데. search를 해보니 물에 녹여 실험을 진행한 논문들이 있습니다. 물에 녹여야 되는 물질을 DMSO에 녹여 세포에 처리를 하여 실험을 진행을 했는데 독성을 나타내지 않았는데, DMSO에 물질을 녹여 세포에 처리하면 물질의 활성이나 세포에 미치는 영향을 받는지 아시는분이 계시면 답변좀 부탁드리겠습니다..
회원작성글 kho1490  |  2021.06.16
Q. 우유와 구조 이성질체
우유를 플라스틱으로 만드는 실험에서 구조에 어떠한 변화가 일어나서 응고가 되는 건가요 그리고 전분이 플라스틱으로 되는 과정에서 어떠한 구조의 변화가 일어났나요 ?
회원작성글 단당류  |  2021.06.15
Q. Sds page 단백질 추출
단백질 추출 (액체질소 이용x) 을 고등학교에서 할 수 있을까요? 방법도 알려주세요 ㅜㅜ
회원작성글 aurora2787  |  2021.06.09
Q. ALP activity assay 키트에 있는 Lysis buffer로 추출한 단백질로 western 시행이 가능한가요?
안녕하세요. ALP activity 측정을 위해 kit (StemTAG™ Alkaline Phosphatase Complete Kit, CBA 301)에 있는 lysis buffer로 단백질을 추출했습니다. ALP를 측정하고 남은 단백질로 그대로 western을 시행해도 괜찮을까요? 키트 상에 lysis buffer의 조성이 따로 적혀 있지 않아서 판단이 어렵네요. 일반적으로 ALP activity 측정을 위한 lysis buffer의 조성이 일반 RIPA lysis buffer의 조성과 차이가 있는지, 있다면 어떤 부분일지 정보를 알고 계신 분이 있으실지.. 감사합니다.
회원작성글 ㅇㅇㅇㅅㅅㅅㅅㅅ  |  2021.06.01
Q. BCA 정량 시 뿌옇게 변하는 현상에 대해 첨부파일
안녕하세요. 문제 해결이 아직 어려운 석사생입니다.   RIPA buffer를 가지고 cell line을 lysis 하는 과정에서 문제가 있는데, 해결이 되지 않아 질문드립니다. 첨부한 사진을 참고하셔서 어느 부분이 문제가 될 수 있는지 조언주시면 큰 도움이 될 것 같습니다.   lysis protocol은   먼저 cold PBS wash, scraper로 harvest, RIPA buffer(+protease inhibitor) suspension 후 vortex, (10 min incubation on ice) sonication, (20 min incubation on ice) 13000rpm 30min centri   의 과정을 거쳐 lysate를 얻었습니다.   이후 정량을 위해 lysate를 96-well 에서 BCA와 섞어주면 첨부한 사진과 같이 뿌옇게 변해버립니다. 사진에서 가장 왼쪽의 맑은 well은 RIPA와 다른 조성으로 만든 lysis buffer를 사용한 sample 인데 큰 문제 없고, 시판중인 RIPA를 사용한 두 번째, 세 번째 well 에서 뿌옇게 변하는 현상이 발생합니다. 아랫줄의 well은 RIPA를 50% 더 많이 넣어준 lysate인데 마찬가지로 탁한 것으로 보아 RIPA의 부족으로 lysis 가 덜 된 것은 아니라고 생각합니다.   protein외에 lipid 같은 것들에 의해 lysate가 뿌옇게 보이는 경우가 있는 것 같습니다. 제 경험으로도 다른 cell 에서 lysate의 상층액에 구름같이 흰 띠가 보이는 경우가 있었는데, 이 cell에서는 그런 층이 보이지 않고, 표면상으로는 별다른 점이 없다가 BCA와 만나는 순간 변해버립니다.   평소에는 RIPA가 아닌 다른 buffer를 사용하지만 RIPA도 정상적으로 사용해 보고자 하는 마음에 문제점을 찾고 있습니다.   혹시 이런 경험을 해보셨거나, 의심가는 부분이 있으신 선생님들이 계시면 조언 부탁드립니다.   감사합니다.
회원작성글 nomask  |  2021.05.26
Q. [Western실험시 lysis 버퍼 조성 질문 드립니다] RIPA 버퍼와 Protease inhibitor
안녕하세요? 석사 1기 학생입니다. 저희 방에서 western blot 실험을 거의 하지 않는데, 제가 맡게 된 프로젝트에서 western blot을 많이 하게 되어 이번에 저희 방에 세팅을 다시 하게 된 상황입니다.   cytosol에 존재하는 protein을 extract할 계획인데요, 논문들을 찾아보니 RIPA buffer와 protease inhibitor cocktail을 섞어서 사용하더라구요. 그래서 sigma-aldrich사에서 RIPA buffer와 Protease inhibitor cocktail 을 구매했습니다. 그런데 RIPA buffer와 Protease inhibitor cocktail을 어느 비율로 섞어서 사용해야 하는지 궁금합니다.   사이트에서 제공하는 매뉴얼은 아래와 같습니다.  * 1 mL of the RIPA Buffer is used to lyse cells from one 100 mm culture dish (0.5~5*107 cells) of most adherent mammalian cell lines. --> 100mm culture dish에 BHK cell을 배양해서 떼어내면 총 1ml의 RIPA buffer를 사용해서 깨면 된다고 하네요..! * 1 mL of Protease inhibitor cocktail solution is recommended for the inhibition of endogenous enzymes found in 100 mL of lysate from 20 g of bovine liver or 10 mL of lysate from CHO cells. This product is supplied as a solution in DMSO. --> 제가 사용하는 cell은 CHO 가 아니고 BHK인데.. 상관 없는 건가요?? CHO는 그냥 대표적인 예로 제시하는 것인가요? 또 10ml 의 cell lysate에 1ml의 protease inhibitor cocktail이 필요하다는 건.. 9ml cell lysate  + 1ml protease inhibitor cocktail 이렇게 10X로 사용하라는 게 아니고 10ml cell lysate  + 1ml protease inhibitor cocktail 이렇게 11X (굳이 따지자면..)로 사용하라는 건가요? 그리고,, 'lysate'라는 표현을 사용하는 것을 보면 RIPA buffer 만으로 cell을 먼저 깨뜨리고 나서 그 후에 protease inhibitor cocktail을 처리하라는 것 같은데.. 논문에서 보면 분명히 '섞어서' 사용하는 경우가 많았거든요..   요약하면,, 100mm culture dish에 키운 mammalian cell을 샘플링하려면 1㎖ (밀리리터)의 RIPA buffer 와 100㎕(마이크로리터 or 람다)의 protease inhibitor를 섞어서 사용하면 되는 것인가요?   답변 주시면 큰 힘이 될 것입니다.. 고견 부탁드리겠습니다. 미리 감사드립니다!
회원작성글 크리스12  |  2021.05.18
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