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BioLab 최수진 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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Q. 전기영동 후 gel에 기포 생성 첨부파일
안녕하세요 PCR 후 전기영동한 gel에 사진과 같이 기포가 생성되었습니다.  겔 제작시  1. 어느정도 식은 겔을 틀에 붓는다. 2. 붓는 과정에서 생긴 공기방울 및 먼지 제거한다. 3. 굳힐 동안 먼지가 들어가지 않게 호일로 덮어둔다.    제작시 먼지와 공기방울의 영향은 크게 없을거라 저는 생각이 듭니다.   선생님들의 의견을 알려주시면 감사드리겠습니다.
회원작성글 해조칼슘풍덩  |  07.22
Q. qPCR melting curve 질문입니다
저는 어떤 유전자의 조직별 발현량을 확인하고 있습니다. 이 유전자의 프라이머를 디자인하고, 밴드도 확인하고 qpcr로 원픽이 뜨는지도 확인하고있습니다. 그런데 자꾸 특정 조직에서난 피크가 두개씩 뜹니다 ㅜ.. 프라이머를 몇번 더 바꿔봤지만 같은 결과가 나옵니다. 도대체 왜 이런건지 이럴땐 어떻게 해야하는지 알려주실수있을까요..
회원작성글 놀고싶다  |  07.21
Q. qPCR dye JOE대신 HEX 사용 가능한가요?
real time PCR dye JOE대신 HEX로 사용 가능한가요? 제가 쓰는 CFX96은 JOE가 없어요.. 그래서 찾아보니 HEX와 파장이 비슷하던데 HEX로 읽어도 될까요?  아니면 Cal gold 540도 비슷하던데 괜찮을까요? 어차피 JOE는 IC (Internal control)입니다 sample dye는 있는데 IC dye가 없네요..
회원작성글 송송ㅇ  |  07.21
Q. 같은 조건에서 realtime pcr 증폭 결과가 계속 바뀌어요
같은 mixture 조건으로 벌크를 만들어서 25ul씩 넣어서 증폭을 하는데 4반복하면 2개는 증폭이 되고 1개는 10~20분 지연되어서 증폭되고 1개는 증폭이 안돼요 다시 해봐도 몇개는 증폭이 되고 몇개는 안되는게 자꾸 반복돼요. 따로 만든것도 아니고 한번에 만든 mixture에서 이럴수가 있나요? 차라리 증폭이 전부 안되면 mixture를 잘못 만들었구나생각할텐데 결과가 자꾸 흔들리니 의문이네요
회원작성글 레뚜로  |  07.20
Q. cDNA RT-PCR 시 희석하면 안되나요?
(나와야하는데) 아무리 해도 안나오는 밴드가 있어서 다른 선생님께 조언을 구했더니 희석하지말고 써보라고 하셔서 그때부터 항상 그렇게 쓰고 있는데 (물론 안나왔습니다.. 프라이머 문제) 그렇게 쓰자고하니 매번 볼륨이 너무 많이 들어가서요.. 25ul cDNA 합성하면 1,000 ng 내외로 나오는데, 여기서 1ul 따서 넣는 것도 말하자면 전체 rx. 볼륨으로 봐선 희석돼서 들어가는 건데.. 어떤 차이인지 궁금하네요..
회원작성글 Crufus  |  07.20
Q. Real-time qPCR 분석 문의 (FAM, TAMRA...)
안녕하세요, Real-time qPCR 기기를 구매하려고 이리저리 살펴보다 잘 모르는 부분이 있어 고수님들의 고견을 구하고자 글 남깁니다. 제가 주로 활용하려는 방법은 Taqman probe assay로 real-time qPCR 분석을 수행하고자 하며, 사용하는 probe는 FAM(Reporter dye)/TAMRA(Quencher)입니다. 이에 맞는 qPCR 기기들을 살펴보다 보니 FAM 까지만 detect되고, TAMRA는 detect 안되는, 하지만 가격이 상대적으로 착한 보급형 기기들도 있더라구요!  Reporter dye로 FAM을 사용하고 Quencher로 TAMRA로 사용하는 probe의 경우, FAM과 TAMRA 모두 detect가 가능한 qPCR 기기를 사용해야 하는지, 아니면 FAM만 detect되는 qPCR 기기를 사용해도 무방할지 애매하여 문의드립니다. 혹시 아시는 분 있으시면 가르침을 구합니다. 감사합니다~
회원작성글 EBEL  |  07.19
Q. DNA추출방법
DNA 추출방법 중에 헷갈리는 부분이 있어 문의 드립니다. Lysis buffer (5mM EDTA, 200mM NaCl , 100mM tris-cl, 0.4% SDS) 1. Lysisbuffer 400ul protinase k 10ul 60도시 O/N 2. 3M potassium acetate 40ul 추가 3. Penol/chloroform/iso-amy alcohol 400ul 넣음 4. Centrifuge 13000RPM 15분 후 상층액 200ul 추출 5. 100% EtOH 500ul 넣음 6. Centrifuge 13000rpm 15분 상층액 버린고 pellet만 남김 7. 70%EtOH 800ul 넣고 centrifuge 13000rpm 15분 상층액 버리고 pellet만 남김 8. Air dye 10분 9. ddH2O , TEbuffer 20-50ul 넣고 4도시에 녹인다. 이방법으로 사용하고 싶은데요 질문은 1. 3M photassium acetate 만들때 ( MW 98.14)100ml 만들때 29.442g 넣으면 되는게 맞는지 2. Penol/chloroform/iso-amy alcohol 이 없을때 그냥 chloroform 이용해도 가능한지 궁금합니다. 아직 많이 부족하여 여쭈어 봅니다.
회원작성글 초코파티  |  07.15
Q. dna extraction이후, 농도 맞추기
안녕하세요 dna extraction이후 농도가 84.4ng / ul이 나왔는데 이것을 100ng / ul로 맞춰야 합니다( 원하는 총 volume은 100ul라고 할 때에) 이럴 경우 100/84.4를 하면 1.2가 나오니까 1.2ul 를 따고, 100-1.2한 98.2를 buffer로 채워주면 되는걸까요 ? 제가 전공자가 아니라 잘 몰라서요.. 이게 맞는지, 그리고 다른 방법이 있다면 말씀해주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 루알  |  07.14
Q. qPCR진행시 PRIMER타려하는데 계산 확인좀요!
qPCR에 사용하는 PRIMER타려고 하는데 100pmol짜리를 5pmol로 타려면 1/20로 타면 돼요? 100pmol시약이랑 M.D.W랑 섞으면 되나요?
회원작성글 iceage  |  07.14
Q. 절대정량 qPCR standard curve의 acceptable한 기준은 어떻게 되나요 ??
 더운 날씨에 다들 고생많으십니다.   항상 실험실 선배님들이 만들어 놓은 primer에 대한 qPCR 절대정량 standard curve를 사용하다가 이번에 새롭게 primer를 짜서 SYBR green을 사용해서 standard curve를 만드는 중에 있습니다.   여러가지 조건을 변경해보아도 새로운 프라이머를 짜보아도, qPCR 효율이 80% 정도에서 크게 변동되질 않더라구요.. error 값도 0.025정도 나오구요..대신 melting peak는 이쁘게 잘 잡힙니다. (Roche LC480장비 사용중입니다.)  qPCR 조건잡기가 생각보다 힘든 것을 몸소 느끼는 중입니다... 그러다보니 그냥 이 결과 값으로 실험을 진행하면 안될까..? 하는 생각이 들어서요...  검색해보면 acceptable한 qPCR 효율은 90~110%정도 되고 R2값은 0.98보다는 높은게 좋다고는 하더라고요..     80% ~ 100% 정도 되는 효율의 qPCR 결과와 0.97~0.99사이의 R2 값을 가진 standard curve로는 데이터 제시에 무리가 있을까요??   추가적으로 물론 3반복이면 좋겠지만... 2반복으로 그려진 standard curve도 acceptable 할까요...?   애써서 분석 다 해놨는데 이런 부분 때문에 나중에 논문 쓸때 문제되진 않을까 싶어서 질문드립니다...   긴 글 읽어주셔서 감사합니다. 답변 가능하시면 답변 해주시면 감사하겠습니다 ㅠ_ㅠ 
회원작성글 Anchovy  |  07.14
Q. PCR 돌릴 때 시간을 잘못 설정하였는데 괜찮을까요?
elongation step은 1 min 만 하려고 합니다. 그러나 elongation은 2 min으로 설정되어있는데 못바꾸고 2 min으로 돌아가고 initial denaturation 말고 그 다음과정인 cycle에 포함되어있는 denaturation 30 sec 로 설정되어있는 부분을 1 min으로 바꿔놔서요... cloning 하려고 pcr 돌려놓는건데 괜찮을까요...?ㅜㅜ 지금 이미 돌아가고 있어서 시간 수정도 불가능합니다
회원작성글 쪼꼬만먼지  |  07.13
Q. 쥐 꼬리에서 추출한 DNA추출 방법
마우스 꼬리에서 DNA 추출방법 이 이렇게 해도 되는지 알려주시면 감사하겠습니다. 원래 genomicDNA 추출 키트 이용해서 뽑았었는데 Lysisbuffer넣고 도 충분히 된다고 하여 했는데 PCR이 잘 안되는거 같아요. 혹시 이 방법이 맞는지 확인 차 질문드려요 Lysisbuffer 100mM Tris HCL PH 8.5 5mM EDTA 0.2% SDS 200mM NaCL 자른 꼬리에 lysisbuffer 500ul , proteinase 5ul 넣고 58도에 O/N 다음날 완전히 lysis된 부분 확인하고 lysis solution 30ul 에 70ul DW 섞어 100도시에 6~7분 PCR template에 맞춰 PCR로 확인 이방법으로 이용해서 처음엔 잘나왔는데 자꾸 PCR밴드가안보이네요... 혹시 추출에 문제가 있는건 아닌지 문의드립니다
회원작성글 초코파티  |  07.13
Q. PCR도 실험자 손맛을 타는건가요
PCR 했을 때 예전엔 band가 잘 뜨더니 갑자기 밴드가 안 뜨다가.. 조건을 좀 달리해서 해봤는데도 잘 안 되다가.. 한 번 시료 피펫팅을 더 조심스럽게(?) 한 적이 있는데 그 때는 또 밴드가 뜨더라고요.. 이것이 우연의 일치인지 아니면 실제로 영향이 있을지 궁금해서 질문드립니다.. 실험자의 마음가짐이 실험에도 영향을 끼치는건가 싶어서요..
회원작성글 창의적인사람  |  07.11
Q. 농도계산..어떻게 하는건지 모르겠어요..ㅠㅠ
안녕하세요 실험실 초보입니다. ddPCR 을 하고자하는데요 Primer, Probe 를 각각 다 따로 구매했습니다. 전부 100uM stock을 만들어 놓았습니다. 1. 20x Primer 또는 Probe 을 어떻게 만드나요.. 2. 20x 같은 x랑 concentration이랑 너무 헷갈립니다. 20x를 어떻게 900nM 또는 250nM 이 되도록 만드나요.. 계속 고민하다가 요청드립니다.ㅠㅠ
회원작성글 초초초초초보  |  07.11
Q. qPCR 22학번 대학원생 Melt Curve 관련 질문입니다! 첨부파일
1. Melt Temperature가 정확히 의미하는 것이 무엇인지 알고 싶습니다.   2. primer CD206의 Melt Temperatur 결과값을 확인하면 값이 각각 차이가 있는 것을 확인 할 수 있는데, 이런 경우 design한 primer의 문제인지 아니면, 실험자의 부주의로 인한 Sample의 오염으로 인한 것인지 궁금합니다.   3. primer CD206의 NE1CM sample의 Peak Height가 두 개가 나왔는데, 이런 경우 PCR 증폭시primer dimer가 형성된 것으로 유추하고 있는데 맞을까요?!   4. Begin Temperature 및 End Temperature의 각 primer별 값의 차이가 실험결과에 영향을 주는지 궁금합니다.   매번 qPCR 결과값이 다르게 나와서 참 답답하네요.. 그래서 이번기회에 PCR의 개념 및 프로토콜을 정확히 숙지하고 실험에 대한 개선방향을 잡고 싶어 질문드립니다. 잘부탁드립니다!!
회원작성글 동한연  |  07.07
Q. 전기영동기 내렸을때 쓸림 현상 없애려면 어떻게 해야 할까요?ㅠㅠ 첨부파일
human neuron cell에서 genomic DNA를 뽑아서 human ALU primer를 보려고 하는데요, AccuPower PCR premix에 genomic DNA 1ul + F primer 1ul + R primer 1ul + Nuclease-free water 17ul 해서 총 20ul로 샘플 제조해서 95℃ 10min, 1 cycle/ 95℃ 15sec, 56℃ 30sec, 72℃ 30sec, 50 cycles (*논문 참고함)로 PCR 돌리고 1.5% agarose gel에 전기영동기 내린 상태인데 계속 쓸림 현상이 나타나고 밴드는 안뜨네요ㅠㅠ 원인이 뭘까요... 아시는 분 답변 부탁드려요ㅠㅠ 사진에 밴드가 나온 것은 human GAPDH primer이고 나머지 2개는 염기서열이 다른 human ALU primer에요...  
회원작성글 스텔라  |  07.06
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