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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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Q. protein extraction 과정 중에서 needle 사용 이유
protein extraction 과정 중에서 RIPA lysis buffer 분주 후 scraper로 긁고 tube에 옮긴 후에 needle로 2 time up-down을 하는데 이렇게 needle을 사용하는 이유는 무엇인가요?
회원작성글 sse  |  2022.01.25
Q. 단위 변환 질문입니다 ㅠㅠ
혼자 갑자기 계속생각하다보니 왔다갔다해가지고 ㅠㅠ 우선 제가 하는 실험결과를 내려고하는데 FW 1mg 당 ug = ug • mg-1 FW FW 1g 당 mg = mg • g-1 FW 라고 표현하지 않나요?? 그리고 단위를 변환하려 할때는  ug • mg-1 FW = mg • g-1 FW 일텐데 이 실험을 들어갈때 시료를 10mg 을 썼거든요  앞에 식에서는 그렇게되면 10을 곱해주면 1mg 단위가되고 뒤에 식에서는 0.01g이니까 0.01을 곱해주면 1g 단위로 되지않을까요..? 근데 이러면 등호가 맞질않으니.. 당연히 틀린것같은데 어디서 실수를 한걸까요? 바보같은 질문입니다 ㅠㅠ 
회원작성글 PHdo  |  2022.01.24
Q. histone protein extraction 과정중 궁금한 점이있습니다.
안녕하세요. histone protein으로 웨스턴을 진행하려고 하는데 브릭에서 whole protein으로 histone 잡아도 별 무리가 없다고 들어 RIFA buffer 사용한 whole protein으로 실험을 하다가 밴드도 이상하고 백그라운드도 많이나와 histone extraction을 해보려고 하는데 문제가 있습니다 ㅜㅜ. 프로토콜은 아래대로 진행했습니다. Harvest cells and wash twice with ice-cold PBS. PBS and subsequent buffers can be supplemented with 5 mM sodium butyrate to retain levels of histone acetylation.  Resuspend cells in Triton Extraction Buffer (TEB: PBS containing 0.5% Triton X 100 (v/v), 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.02% (w/v) NaN3) at a cell density of 107 cells per ml. Lyse cells on ice for 10 min with gentle stirring. Centrifuge at 6,500 x g for 10 min at 4°C to spin down the nuclei. Remove and discard the supernatant. Wash the nuclei in half the volume of TEB and centrifuge as before. Re-suspend the pellet in 0.2 N HCl at a density of 4x107 nuclei per ml. Acid extract the histones over night at 4°C. Centrifuge samples at 6,500 x g for 10 min at 4°C to pellet debris. Save the supernatant (which contains the histone protein) and neutralise HCl with 2M NaOH at 1/10 of the volume of the supernatant. Determine protein content using the Bradford assay. Store aliquots at -20°C. 위 과정에서 궁금한점이 7번단계에서 over night 말고 3시간정도 해도 교수님이 충분하다고 하시던데 괜찮을까요? 그리고 교수님은 actid extraction하고 나서 RIFA buffer 넣어주면 9번 중화 단계는 필요없다 그렇게 말씀하시던데.. 제가 실제로 acid extraction over night 이 후 supernatant를 얻어 rifa buffer(PIC를 안넣었습니다.. 깜박하고 ㅜㅜ) 넣으니 뿌옇게 변하더라구요.. 그래서 다른 분들은 어떻게 중화를 시키시는지 궁금하여 이렇게 질문 올립니다. 
회원작성글 힒듦닮  |  2021.12.17
Q. transwell harvest
안녕하세요 실험 중 궁금한것이 있어 질문드립니다. 6well trnaswell에 각각 다른 cell을 seeding 해서 protein 추출 후 western blot을 진행하려고 하는데 harvest 할 때 어떤 방식으로 진행하는지 알 수 있을까요? 찾아보는 중인데 harvest protocol은 안나오는거 같더라구요ㅠㅠ
회원작성글 avocado  |  2021.12.14
Q. 포르말린에 고정한 조직에서 protein 추출 가능한가요?
안녕하세요. 마우스에서 샘플링한 Tumor tissue를 약 두달간 포르말린에 고정해서 보관해 두었는데요. 혹시 이 포르말린 조직에서 웨스턴 블랏을 위한 단백질 추출이 가능할까요? 제가 시험삼아서 조직을 단면 면도칼로 잘게 다진 후, 세포추출에 사용하던 RIPA에 3일간 4도씨 냉장보관하면서 단백질 추출을 유도해 보았는데, 단백질 검출이 되질 않아 문의드립니다ㅠ 단백질 검출은 BCA assay로 확인했어요. 호모게나이저로 다져봐도 RIPA에는 추출이 안되는데, 혹시 원래 포르말린 고정한 조직은 단백질 추출이 안되는 건지 궁금하네요.. IHC는 잘 되는데 단백질 추출인 안되는 게 왜 그런지 잘 모르겠습니다..  
회원작성글 대학원생인가노예인가  |  2021.12.14
Q. 발효 단백 가수분해물 SDS-PAGE
안녕하세요.   특정 시료를 발효시켜 단백질 가수분해를 진행하려고 합니다.   발효 후 상등액을 바로 SDS-PAGE 해야하는지, 아니면 상등액을 동결건조 후 희석하여 쓰는 것이 맞는지 모르겠습니다. 아니면 실험 목적에 따라 다른 것인지...   발효 후 상등액을 바로 쓴다면 냉동보관 후에 사용해도 될까요? 
회원작성글 sfa333  |  2021.12.11
Q. Ni-NTA를 이용하여 protein purification할 때 dna는 어떻게 되나요?
안녕하세요!! 아직도 많이 부족한 석사생입니다. 단백질을 정제하다가 문득 든 생각인데, Ni-NTA를 이용해서 protein을 정제할 때, histidine과의 수소결합?을 통해서 정제하는 거잖아요? 그렇다면 ni과 dna와의 결합도 가능하지 않나요?(ni이 +, dna는 -) 그런데 이거와 관련해서 나온 자료는 없네요... 제가 뭔가 잘못 생각하고 있는 것 같은데,,,고수님들 소중한 답변 부탁드리겠습니다!!ㅠㅠ
회원작성글 어릴적올챙이  |  2021.12.04
Q. 단백 가수분해물 상등액? 분말?
특정 분말 시료를 발효시켜 단백질 가수분해를 하려고 합니다.   발효 후 상등액을 쓰는 것이 맞나요? 아니면 분말을 사용하는 것이 맞나요?   아니면 실험 목적에 따라 다른건지...   분말을 사용하는 문헌도 있고 상등액을 사용하는 문헌도 있어 헷갈리네요..
회원작성글 sfa333  |  2021.11.29
Q. IPTG 로 protein을 뽑고 싶을 때.. BL21말고 DH5a를 사용해도 되나요?
IPTG를 사용하여 단백질을 뽑으려고 하는데요 transformation 할 때 BL21 말고 DH5a도 괜찮나요..?  예전 protocol은 bl21 이긴 한데 지금 DH5a 밖에 없는 거 같아서요
회원작성글 eogkrtod  |  2021.11.22
Q. Mitochondria isolation 후 WB 에 대한 질문입니다
    현재 저는 mitochondria isolation 후에 quality control을 위해 WB을 진행중입니다. 그래서 ER marker인 calnexin을 디텍션 해 보았더니, control (RIPA만 사용해서 뽑은 protein)에서는 밴드가 뜨지 않고, isolated 된 mitochondria 샘플에서만 미세하게 밴드가 떠서 당황스럽습니다. 혹시 제가 무언가 놓치고 있는 부분이 있을까요? (mitochondria는 2% CHAPS로 뽑았습니다...)
회원작성글 또잉  |  2021.11.11
Q. Protein in solution digestion 진행시.....
Protein in solution digestion 진행시 사용되는 buffer 들이 물슨 역할을 하는지 궁금 합니다. 1.ABC buffer 2.Urea buffer 3. IAA buffer 4. DTT buffer
회원작성글 불곰탱이98  |  2021.11.10
Q. hplc분석 관련 질문.. 왕초보입니다.
안녕하세요, HPLC 왕초보입니다.   최근에 HPLC에 대해 공부를 시작하게 되었는데.. 혼자서 공부하려니깐 이해되지 않는 부분들이 너무 많아 답답함이 있어서요...!   1) 역상 컬럼 일반적으로 C18컬럼을 많이 사용하는데, C18컬럼은 소수성이 강한것으로 알고 있습니다. 그래서 소수성이 강한 물질을 분석하게 되면, 소수성 상호작용을 하기 때문에 더 천천히 내려오는 것으로 알고있습니다.   그렇다면, 소수성이 강한 물질을 분석할때는 C18, 친수성이 강한 물질을 분석할때는 C8이나 C4를 사용하는게 맞나요? 어떤 제품 자료를 읽어보면 C4컬럼인데 "낮은 소수성 컬럼으로 소수성이 매우 강한 분석물질에 대한 탁월한 머무름 및 분리" 이런식으로 기재가 되어있어서 헷갈리네요..ㅠ   2) C4컬럼 일반적으로 폴리펩타이드나 단백질분리할때 SEC컬럼도 사용하지만 역상 컬럼도 사용하는 것으로 알고있는데, 단백질의 크기가 클수록 C4, 작을수록 C18컬럼을 사용한다고 하죠..? 그 이유를 잘 모르겠습니다. C18와 C4는 소수성의 차이만 있는게 아니었나요? 단백질의 크기에 따라 분리하려면 pore size를 확인해야하는게 아닌가요..? 왜 단백질 크기가 클수록 C4 컬럼을 사용하는지요?   제 지식이 너무 짧아서, 너무 기초적인 질문들일 수 있는데.. 혼자 공부하다보니깐 이 이상 진도가 잘 나가지 않네요 ㅠㅠ 도와주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 lc분석왕초보  |  2021.11.08
Q. FPLC에서 다른단백질들과 비교했을때 크기는 더 작은데 더 빨리 나오는 경우가 있다. 이에 대한 과학적 이유.
SPEED  |  10.27 23:03           FPLC에서 다른단백질들과 비교했을때 크기는 더 작은데 더 빨리 나오는 경우가 있다. 이에 대한 과학적 이유. 1. 컬럼 사용한지가 얼마나 되었나요? - 컬럼은 꽤 오래사용했습니다 . 5년 정도 2. 컬럼 세척은 어떻게하나요? 물로 싹 헹궈줍니다.  3. 컬럼 종류와 순서가 바뀌는 단백질 분자량이 각각 얼마인가요? beta9, beta12, slo ago, hucR 단백질이고 각각 63,63,94, 20kDa입니다.  
회원작성글 poiwue  |  2021.10.27
Q. FPLC에서 다른단백질들과 비교했을때 크기는 더 작은데 더 빨리 나오는 경우가 있습니다. 그 과학적인 이유는 무엇인가요?
FPLC에서 다른단백질들과 비교했을때 크기는 더 작은데 더 빨리 나오는 경우가 있습니다. 그 과학적인 이유는 무엇인가요?
회원작성글 poiwue  |  2021.10.27
Q. e.coli 에서 protein 추출할 때 어떤 buffer를 사용해야할까요ㅠㅠ
e.coli에서 단백질을 뽑아야하는데 저희 실험실에서 제가 거의 처음해보는 거라 물어볼 선배들도 없고요ㅠ   검색해보니 sonication이 젤 간단한 protocol인거같은데.. 어떤 buffer에 resuspension 시켜야할까요.. PBS를 사용해도 괜찮은가요?   
회원작성글 eogkrtod  |  2021.10.21
Q. Mitochondrial fraction 질문 입니다.
안녕하세요 현재 대학원 진학중인 학생 입니다.  이번에 박사님이 tissue 에서 mitochondrial fraction을 한 후 western blot을 하여 결과를 보자고 하셨는데... 제가 mitochondrial fraction 하는 방법을 잘 몰라서요..ㅠㅠ  ros 측정 시 sucrose buffer를 이용해 분리는 해 보았는데 이 방법과 비슷하게 시도해도 되는지 의문입니다. 제가 생각하기에는 말이 안 되는 것 같은데... 혹시 실례가 되지 않는다면 mitochondrial fraction을 어떤 방식으로 하는지 알려주실 수 있으신가요?ㅠㅜㅠㅜ
회원작성글 코코아  |  2021.10.20
Q. cloning 이 갑자기 안돼서 질문 드립니다. 첨부파일
저는 현재 클로닝실험을 진행하고 있는 대학원생입니다. 실험이 너무 안 돼서 고수님들께 부탁드리는바입니다. insert를 vector에 넣기만 하는 작업을 하고 있는데, 제가 실험코자하는 유전자가 3개정도 되는데 2개는 이미 클로닝을 완성했고 남은 하나를 진행하고 있는데 여러가지 문제에 부닥치게 되었습니다.  질문1: 저의 유전자가 들어있는 E.coli가 항생제가 들어있는 LB 액체배지에서 전처럼 잘 자라지 않습니다. 그 이유는 무엇인가요?(참고로 대장균은 DH5a이며 1달전에 transformation하여 딴 single clony입니다.) 혹시 신선한 대장균이 아니여서 일가요? 질문2: gel extraction을 진행하려고 insert를 10ug당 Xbal 과 Spel을 3ul 씩 overnight 처리후 전기영동을 내리면 제가 원하는 insert는 매우 가늘게 나타나고 있습니다(사진을 첨부하여 드립니다). 그 이유는 무엇을가요? 제 생각에는 enzyme 처리가 안댄 부분이 더 많다고 생각됩니다만 이유가 궁금합니다. 질문3: vector : insert =3:1(gel extraction후 insert의 농도가 그 전보다 낮게 나와서 insert의 비율을 적게 했음) 로 ligation후 transformation을 진행한 결과 콜로니가 너무 많이 떠 있었습니다. 그중에서 10개의 single clony를 따서 전기영동을 진행했더니 다 self였던 것입니다. 저는 두가지 종류의 enzyme 을 사용하는데 왜 self가 이렇게 많이 뜨는건가요? 정말 궁금합니다!! (두가지 enzyme 모두 새로 사서 것들입니다.)   마음이 많이 급해서 이렇게 무작정 글을 올립니다.답변 부탁드립니다~~ㅠ
회원작성글 JK7  |  2021.10.05
Q. 단백질 추출(protein extraction)
단백질 추출시 루비스코의 양을 줄이기 위해서 Protamine sulfate를 쓰는데 원리가 무엇인가요??
회원작성글 ifi  |  2021.10.05
Q. e.coli 에서 total 및 soluble한 protein prep.. 간단한 protocol이 있을까요..?ㅠ
e.coli에서 total 및 soluble한 protein을 prep하고 싶은데,,, 사실 protein쪽으로 잘 안해보고 몰라서 검색해도 잘 모르겠어서 질문 올립니다ㅠㅠ 간단하다고는 들었는데 주변에 물어볼 사람도 없고 그래서 힘드네요 찾기가ㅠㅠ   
회원작성글 eogkrtod  |  2021.09.06
Q. PD-10 column 사용 시 문의
안녕하세요.   제가 지금 재조합 단백질을 Ni-IDA 컬럼을 이용하여 분리정제하고 이를 PD-10 컬럼을 이용하여 imidazole을 제거하고자 합니다. 사실 단백질 가용화 시 CHAPS 1%를 사용하였고, 분리정제에도 CHAPS 1%가 포함된 버퍼를 제조하여 모든 실험을 진행하였습니다. 최종적으로 PD-10 컬럼을 이용하여 imidazole과 CHAPS를 동시에 제거하려했는데, 희석과 더불어서 굉장히 broad하게 단백질이 용출될 뿐만 아니라 단백질 손실이 굉장히 컸습니다.   (1) 만약 detergent가 없어져 단백질이 불안정해지면 위와 같은 현상이 발생하게 될까요. (2) PD-10 컬럼에서도 CHAPS 1%가 포함된 버퍼로 평형화를 해야할까요. (3) 추후 detergent를 제거하기 위해서는 어떻게 해야할까요. 꼭 필요할까요.   여러분들의 고견을 묻습니다.
회원작성글 arklion  |  2021.09.06
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