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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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Q. RT-PCR 후 밴드를 확인하는 실험중입니다
안녕하세요. 석사과정 실험중인 학생입니다. 다름아니라 제가 qPCR을 처음에 진행했다가 결과가 들쑥날쑥하여 우선 RT-PCR 후 아가로스겔로 밴드를 확인해보는 걸 하게 되었는데요. 제가 처음에 잡은 조건은 아래와 같습니다. 둘다 cDNA 25ng/ul를 사용하였고 왼쪽은 30사이클 오른쪽은 베타엑틴으로 25사이클을 돌린것입니다. nc가 보이지 않아 정량을 할수가 없다고 하여 사이클을 바꿔서 다시 재실험하였습니다. 동일샘플을 왼쪽은 35사이클 오른쪽은 20사이클을 돌린것인데 희미하게 nc가 보여 정량을 해보니 4번째 레인 PC가 NC대비 7배 증가하는 것으로 나왔습니다. 동일샘플 웨스턴 실험결과에서는 4번째레인 PC가 NC대비 2배 증가하는 결과가 나왔습니다.  따라서 RT-PCR결과와 웨스턴결과에서 7배와 2배, 둘이 너무 많은 차이가 나기때문에 데이터가 의심스럽다며 RT-PCR을 재실험해보라는 조언을 들었습니다. 브릭을 찾아보니 cDNA 농도가 너무 높거나 사이클을 많이 돌리면 결과가 다르게 나타날수도 있다고 하더라구요. 제가 cDNA 농도를 너무 높게 사용하거나 사이클을 많이 돌리고 있는건가요..? 또 RT-PCR에서 cDNA 농도나 사이클말고도 어떤 변수들에 의해 결과가 달라질 수 있는지도 궁금합니다.  또 image j로 rt-pcr 밴드들 정량하는 방법도 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 slide  |  2021.09.13
Q. RefSeqGene으로 primer를 짜도 mRNA 수준 확인 가능한가요?
안녕하세요. 특정 유전자들의 mRNA 수준의 변화를 확인하려고 NCBI에서 시퀀스 정보를 찾고있습니다. 제가 보려는 유전자가 죄다 Transcript variant 정보밖에 없어서, RefSeqGene으로 primer를 짜서 RT(reverse transcriptase)-PCR을 통해 mRNA 수준에서 유전자 발현 변화를 보려고 하는데요. 이론적인 배경이 부족해서 그런지 확신이 잘 안서네요 ㅠ
회원작성글 대학원생인가노예인가  |  2021.09.08
Q. SSTE buffer 제조 시 뭉침 현상
CTAB 방법으로 RNA extraction을 하려고 합니다. SSTE buffer 제조 시 하얗게 뭉침 현상이 있어요. 침전이 되는 것은 아니고 물에 우유 떨어진 것 처럼 solution에 하얗게 둥둥 떠있습니다. NaCl powder를 dw에 녹인 상태에서 SDS stock을 넣으면 넣자마자 바로 그렇게 됩니다. 무엇때문인지 알아보려고 대충 섞어보니 NaCl powder를 정량보다 적게 넣으면 그런 일이 없더라구요. (조성을 원래 비율대로 섞으면 시약이 아까워서 일단 시약 문제인지 알아보려고 눈대중으로 슥슥 넣고 만들어본건데 무슨 상황인지 이해가 가실지 모르겠네요.) SDS 원래 특성이 그런것인지 아니면 뭔가 잘못하고 있는건지 모르겠어서 질문 올립니다. + 좀 더 검색해보니 SDS와 NaCl이 만나면 micelle formation이 일어난다, SDS를 salting out한다 이런 표현들이 나오는데, 혹시 이런 현상때문에 그런걸까요? 
회원작성글 Perilla R.  |  2021.09.01
Q. mRNA 구조 안정성, 에너지
안녕하세요 이번에 subcloning을 하여 SDS PAGE를 진행했는데 발현이 안되는 것을 확인하였습니다. 그래서 왜 발현이 안되었을까 라는 이유를 여러가지 찾다가 codon usage, RBS 거리, cloning에서 문제 등등 찾아보았는데 다 괜찮았던것 같은데   RNA안정성, mRNA 구조 안정성과 에너지 값, 2차구조 안정성과 같은 문제도 있을 수 있다고 들었습니다. 근데 제가 RNA 안정성, 에너지값을 어떻게 구하고 무엇을 참고해야하는지 몰라 어려움을 겪고 있습니다. 관련 논문이나 방법, 노하우 또는 다른 아이디어있으시면 한말씀 부탁드립니다    
회원작성글 M37  |  2021.08.30
Q. PCR, preincubation 관련 질문
pcr할때 preincubation을 보통하는데 하는 이유가 enzyme 활성화라고 알고 있습니다.   근데 보통 논문 찾아보면 pre-incubation time이나 온도가 따로 안적혀 있는데....보통 이럴경우에는 pre-incubation time을 어떻게 설정하는것이 좋을까요.??  
회원작성글 1045  |  2021.08.25
Q. pcr 질문
안녕하세요.   real time PCR에 대해 질문이 있습니다.   보통 PCR에서 denaturation, anneling, extention 단계가 있는데 다른논문을 참고해서 primer를 짜려고하는데 조건이   95℃에서 15초간 변성(denaturation) 과정을 거치고 60℃에 서 45초간 결합(annealing) 반응을 시킨 후, 이러한 과정을 40회 반복하였다 라고 쓰여져있습니다.   extention 과정이 없는데 extention 과정이 없어도 되는거인가요..?   아니면 생략을 한거 일까요...?   추가적으로 다른 논문 PCR 조건에서는 50도 10분 + 95도 5분, 95도 10초 + 60도30초 39 사이클 조건이라고 써져있습니다.....여기도 extenion 조건이 없는데  없어도되는걸까요 아니면 생략일까요...
회원작성글 1045  |  2021.08.25
Q. qRT-PCR 그래프 해석 중 궁금한 점이 있어요 첨부파일
RNA prep하여 qRT-PCR을 진행하는데 앞에가 맞는 피크인데 자꾸 뒤에 다른 피크가 하나 더 뜹니다 (사진첨부) 왜그런지 알려주실 수 있나요?ㅠㅠ  계속 같은 primer에서 나오는 것 같다가도 간간히 다른 primer에서도 뜹니다.  원래 피크 앞에 생기는 것이 primer dimer라고 알고있는데 뒤쪽에 다른 피크가 생기는것도 primer dimer라고 볼 수 있는건가요? 그렇다면 primer 농도를 낮추면 해결될까요?
회원작성글 스으라아  |  2021.08.25
Q. real time pcr 실험 관련
현재 Real time PCR을 이용하여 Sample의 knockdown 정도를 확인하는 실험을 진행 하고 있습니다. 실험하는 과정에 있어 문제가 생겨 글을 올리게 되었습니다. Real time PCR을 돌리고 나서 Ct값이 undetermined라고 값들이 계속 나오는데 이러한 값이 나오는 이유를 찾아보았는데 맞는것인지 궁금합니다. 실험에 사용하는 House keeping gene은 GAPDH를 사용하고 있고, 각 Sample들의 농도들이 다 달라서 농도의 여유가 있을경우에는 1000ng으로 cDNA 합성을 하고 농도가 낮은 Sample의 경우에는 10ng or 100ng으로 합성하여 사용을 하고 있습니다. Real time pcr을 실험을 할때 같은 sample로 3번 정도 돌리고 있는데 House keeping gene Ct값의 결과중에 undetermined라고 나오는데 이렇게 나오는 이유가 실험에 사용한 primer가 제가 원하는 target sample에 맞지 않아서 이러한 값들이 나오는지 궁금합니다. 그전에도 계속 사용하던 primer이기 때문에 혹시 다른 이유들이 있는지 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 전기대학원생  |  2021.07.29
Q. mRNA 백신연구에서 LDP만을 이용하는 이유가 무엇인가요?
안녕하세요 생명공학 분야로 진학을 희망하는 고2 학생입니다! mrna 백신에서 LNP가 핵심기술이라는 것과 국내에 LNP 기술이 부족해 개발이 더딘 상황이라는 알게 됐습니다. LNP가 가장 널리 쓰이는 나노전달기술이기는 하지만 크기, 균일성 및 안전성을 제어하는 데에 어려움이 있다고 알고 있습니다. 그런데도 고분자 기반 나노 입자나 하이브리드 엑소좀 등 더 효과적이라고 알려진 기술을 도입하지 않고 LNP 개발에 주목하는 이유는 무엇인가요?? (일부 회사에서 다른 전달 기술을 연구중이긴 하나 주류가 LDP인 것으로 알고 있습니다) 주변 자문을 할 사람이 없어 글 올렸습니다ㅠㅠ 감사합니다!!
회원작성글 angelashin..  |  2021.07.11
Q. qPCR mRNA expression
안녕하세요 최근 primer를 짜서 qPCR 실험을 진행하게 되었는데요.. 1가지 mRNA에 대해서 10개 정도의 primer를 짜서 qPCR을 진행해 보았습니다. 그런데 이상한것이 CDS 부위로 primer를 짜서 qPCR을 한 것은 거의 변화가 없는데 CDS 앞쪽 (CDS 부위 X)으로 primer를 짜서 qPCR을 돌린것을 20배 이상 차이가 나네요.. CDS 부위가 아니면 의미가 전혀 없는 것인가요? ct 값은   CDS primer : cont (25-26), overexpression (24-25) CDS 앞부분 primer : cont(34-37), overexpression (27-31)   이것도 의미가 있는것일까요?    
회원작성글 화이팅구  |  2021.07.06
Q. mRNA를 in vitro에서 합성하려고하는데 질문이요 ㅠ
실험실에서 RNA work을 처음 세팅하고 있어서 모르는 점이 많습니다!   mRNA를 바로 cell에 transfection 하여 변화를 확인하고자 하며, cell에 얼마나 uptake되는지 보기 위하여 GFP도 달고 싶습니다. 일단은 회사에 합성 의뢰해서 테스트를 해보려 하는데 가지고 있는 template가 없어서 gene 합성부터 진행해야 하는데, GFP를 포함한 모든 서열을 알려줘야 견적을 줄 수 있다고 하네요.. 처음 혼자 찾아보고 있어 몇가지 질문 드립니다!   1. 이 경우 아래 첨부된 사진의 mRNA 서열 1부터 1897까지 모두 긁으면 되는 것 맞나요? 그럼  5'UTR과 CDS, 3'UTR 모두 포함되는 것일까요?   2. 저는 소 (bovine) 세포에 transfection 할건데, GFP 서열은 어떻게 찾아야할까요..? NCBI 찾아보면 Synthetic construct EGFP (EGFP) gene, complete cds 랑 mouse eGFP mRNA가 있는던데.. synthetic construct eGFP 서열을 적용하면 되는걸까요??   3. 하나의 mRNA에 GFP tagging, target gene을 넣으려면 순서를 어떻게 연결 해야할지...  Target gene mRNA 서열 (5'UTR,CDS,3'UTR) - GFP mRNA 서열 (5'UTR,CDS,3'UTR) 이렇게 붙이면 되는 것일까요??  아니면   Target gene의 5'UTR- target gene의 CDS, GFP의 CDS - target gene의 3'UTR 이런식으로 연결을 해야하는 것일까요?ㅠㅠ 이럼 target gene만 번역되고 끝날 것 같은데..   의견 주시면 큰 도움 되겠습니다.. 감사합니다............!            
회원작성글 GE  |  2021.06.30
Q. RNA polymerase 관련
안녕하세요 RNA polymerase 관련하여 질문드립니다. RNA 를 만들때 Single primer 또는 DS DNA 에서 polymerase를  이용하여 만드는걸로 알고 있는데.. SSDNA에서 어떤 polymerase를 이용하여 RNA를 만드는지 알고싶습니다. 많은 정보 부탁드립니다. 감사합니다.    
회원작성글 kimk1128  |  2021.06.24
Q. 낮은 mRNA 발현량 원인 구분 방법
단백질 발현량에 영향을 주는 단계 중 a) DNA에서 RNA로의 transcription 단계가 진행이 안되서 mRNA 가 적은 것 인지,   b) 아니면 RNA 제거(miRNA, RNA Decay)에 의해 transcription 되었던 mRNA가 분해되어서 적게 존재하고 translation이 안되는 것인지   cell 이나 조직마다 다를 것 같은데 어떻게 구분할 수 있나요? 이걸 구분해 놓은 Database가 존재하나요?    
회원작성글 rowanlee  |  2021.06.24
Q. Transient vector expression시 mRNA발현량이 어느정도 될까요??
유전자조작없이 mRNA로 transdifferentiation 이 가능한지 테스트 해보려고 하는데요, mRNA를 지속적으로 cell에 넣어주는거보다 cDNA를 벡터에 넣어서 벡터채로 transfection하여 transient하게 expression시켜주는게 더 효율적이지 않을까 생각했습니다. (stable cell line 구축하는게 아닙니다) 벡터채로 transient expression 시켜주는 거랑, mRNA를 넣어주는거랑 mRNA 뱔현량이 어떤게 더 효율적일까요??
회원작성글 GE  |  2021.06.22
Q. RT-PCR mRNA expression primer design
안녕하세요. 제가 Primer design을 하려하는데 목적은 RT-PCR로 mRNA 발현양을 보는것입니다. 해당 gene의 sequence를 기반으로 design하는 중인데 primer 결합하여 증폭되는 부분이 꼭 CDS안에 포함되어야하는건가요 ? 아니면 그렇지 않아도 되나요? 답변부탁드리겠습니다 !
회원작성글 qjofjo  |  2021.06.22
Q. Quantstudio5, melt curve 그래프가 안나와요 ㅠ
qPCR 진행하고 나서 target1의 경우 melt curve plot에서 그래프가 나오지만 target2와 gapdh의 그래프가 tm만 표시 되고 그래프가 안나옵니다. Export해서 엑셀로 보면 tm값이랑 peak값도 있는데 그래프가 안나오는 이유가 있을까요? ㅠ
회원작성글 왕초보석사생  |  2021.06.17
Q. melting curve에 관하여 알려주세요 그리고 VE cadherin이 무엇인가요?
실험 초보입니다. 제목과같이 제가 이해를 하지못해서 혹시 설명을 해주실수있을까요? melting curve분석하는 방법도 알려주십시요! CT값이 높을 수록 VE cadherin의 농도가 높은것일까요
회원작성글 은혜혜참진  |  2021.06.13
Q. RT-PCR 시 oligo dT와 random hexamer 질문
안녕하세요. RT-PCR 시 각각의 oligo dT, random hexamer, specific primer를 선정하는 이유는 알고 있습니다. 그러나 oligo dT와 random hexamer를 섞어서 실험하는 경우도 있더라구요. 이렇게 섞는 이유가 무엇인지 궁금합니다.. 도대체 어떤 이점이 있어서 섞는지.. 그래서 제가 virus RNA를 트리졸을 사용하여 메뉴얼대로 추출한 다음 각각의 oligo dT, random hexamer, oligo dT와 random hexamer를 혼합한 primer set 그리고 virus specific primer set로 cDNA를 제작한 다음 10-fold dilution으로 10^-7까지 희석하여 virus specific primer로 PCR를 진행한 뒤 전기영동을 실시하였습니다. 결과는 oligo dT를 제외한 나머지 primer로 제작한 cDNA sample이 증폭효율이 더 좋더라구요. band 상에서 100배의 희석배수 차이를 보였습니다. 질문 1. 왜 oligo dT 단독보다 random hexamer를 혼합하였을 때 효율이 좋아졌는지 궁금합니다. 질문 2. 3`의  poly A tail에서 신장이 되면서 중간에 random hexamer가 붙어있을 경우엔 서로 방해가 되는 것이 아닌가요? 질문 3. RT enzyme에 displacement activity가 있다고 하는데 제가 잘 모르는 부분이라 자세히 알려주실 수 있나요..? 감사합니다..   
회원작성글 실험실뉴비2  |  2021.06.09
Q. 논문을 통한 Primer 구매 관련 질문
안녕하세요,  재료 기반의 연구를 하는 석사생입니다.  다름 아니라, 본의 아니게 RT-PCR을 수행해야 하는 상황이 왔는데, 저희 연구실이 바이오 기반이 아니라 마땅히 물어볼 곳이 없어 이리 질문 올리게 되었습니다.  제가 보고자 하는 target gene에 대해서 primer를 사야하는데요, 제 전문분야도 아닌데 primer 디자인하는 법을 찾아 공부하고 직접 design 해서 실험하기까지, 소요시간이 많이 걸릴 것 같단 생각이 듭니다.   논문을 참고하면 논문에 사용한 primer의 sequence를 공개하던데요, 제가 보고자 하는 target gene과 논문에서 사용한 gene이 같다면, 그 논문에서 공개하는 sequence를 그대로 사용해도 괜찮은건가 싶어 이리 질문드립니다. 만약 그렇다면, 직접 디자인한 것과 논문에서 공개된 sequence 를 가지고 주문한 primer의 효율이 많이 다른지도 궁금하네요.   초보같은 질문이겠지만, 조언좀 부탁드립니다.  
회원작성글 시작임님  |  2021.06.09
Q. [끌올] 세포수와 RNA 보정관계- 과거 한 연구자의 질문에 대해 재질문 드립니다
안녕하세요, RT-PCR에 대해 여러가지 검색을 하다가, 과거에 한 연구자분이 올린 질문에 대해 저도 의문이 들고 궁금증이 안 풀려, 이리 재질문을 드립니다. 질문의 요점은 아래와 같은데요. 일반적인 PCR 방법대로, 세포수별로 total RNA를 뽑고 같은 양으로 RNA 정량을 해서 cDNA를 합성하고, housekeeping gene의 대표인 beta-actin과 타겟을 각각 돌린상황에 대해서, control 이나 실험군 모두, 같은양으로 RNA를 정량을 해서 진행한 PCR결과는, 타겟gene의 양은 다를지라도 적어도 beta-actin의 밴드 굵기는 같아야하지 않아야 하는지에 대한 문의였습니다. 지난 질문을 하신 연구자의 결과에서는 밴드의 굵기가 달랐나 봅니다. 여기서 저 역시 갑자기 든 의문점이, 예를들어 만개의 세포와 천개의 세포에 대해 total RNA extraction 하고 RNA를 정량해서 같은양의 RNA로 정량해 PCR을 진행했다면, Housekeeping gene에 대한 밴드의 굵기는 이론적으로 당연히 같아야 한다고 생각하는데요. 여러분의 생각은 어떠신지요? 만약 아니라면 이론적으로 설명 부탁드립니다. 감사합니다. 원문주소는 아래와 같습니다. https://www.ibric.org/myboard/read.php?id=441677&Board=exp_qna
회원작성글 시작임님  |  2021.06.09
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