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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. carrier RNA 없는 RNA extraction kit
안녕하세요? 저는 Qiagen사의 QIAmp Viral RNA Miniprep kit를 사용하여 virus로부터 RNA를 추출하고 있습니다. 그런데 이 키트에 carrier RNA가 들어가서 Nanodrop으로 추출 전후 RNA 농도 비교에 어려움을 겪고 있습니다. 혹시 carrier RNA를 사용하지 않는 RNA 추출 키트를 추천해주실 수 있으실까요?
회원작성글 너와나의벤젠고리  |  01.10
Q. human PDL cell
안녕하세요 이제 대학교를 졸업하고 연구실에서 초보 인턴을 하고있는 학생입니다 사랑니를 발치해서 pdl cell을 culture에서 rt-pcr을 돌릴려고 합니다 문제는 여기서 PDL cell을 통해 RNA 추출해야하는데 어떻게 해야하는지 모르겠습니다 단순히 사랑니의 pdl을 긁어서 추출해보니 rna양이 적어서 그런지 추출이 안됩니다 혹시 어떤 방식으로 해야하나요? 혹시 cell culture을 해야하는거면 하시는 protocol이 있으신 분있으신가요? 막막하네요ㅠ
회원작성글 윤초이  |  2021.12.17
Q. RNA Vaccine, DNA Vaccine 연구할때,
RNA Vaccine, DNA Vaccine 연구할때, 내가 만든 Vaccine 이 정확하게 만들어졌는지? 적당량을 원하는 농도로 sample 병에 분주하려고 하는 경우, 어떤식으로 연구를 하는 것인지? 현재의 실질적으로 사용하는 방법을 알고 싶습니다. 개론적으로라도 답변 주시면, 다시 구체적으로 질문 update 하겠습니다. 감사합니다.
회원작성글 굿바  |  2021.12.16
Q. RNA
수업 들으면서 RNA isolation 한건데 결과가 안좋습니다.. ㅜㅜ  질문 드리고 싶은것은 왜 18s rrna 위치가 오른쪽에 잘 나온 모범 사례의 위치와 다를까요?  왼쪽 젤은 래더가 전체적으로 밀린 느낌이 드는데 아가로스 젤에서 래더만 밀릴수있나요? 있다면 왜 그런건가요? 
회원작성글 Edenite  |  2021.11.27
Q. Trizol로 RNA 추출시 isopropanol
Trizol로 RNA 추출시 isopropanol 100% 사용하나요? 70% 100% 각각해봤는데 100% 넣었을때는 넣자마자 뿌옇게 변하던데 70%는 아무런 변화 없었어요 아직 ethanol 처리중이라 나노드랍은 못했어요ㅠ
회원작성글 우닝  |  2021.11.18
Q. RNA 추출 시 chloroform을 두 번 넣으면?
학교에서 RNA 추출 실험을 했는데 실수로 chloroform을 넣고 원심 분리 한 뒤에 상층액을 꺼낸 후 Isoprophanol을 넣어야 하는데 chloroform을 이전에 넣었던 양 만큼 다시 넣었는데...물론 실험을 고대로 망했구요.. 그런데 chloroform 다시 넣으면 RNA 추출이 힘든지 그 이유를 잘 모르겠어요..ㅠㅠ  왜그런지 알려주세요
회원작성글 hogangster  |  2021.11.11
Q. RNA extraction과 RNA 농도
안녕하세요 질문이 있어 글을 씁니다. 우선 저는 cell에서 RNA 추출하는 실험을 했습니다. 현미경 관찰시에 cell 수가 많았음에도 불구하고 chloroform을 넣고 centrifuge를 한 뒤에 pellet이 보이지 않았지만, 추출 후 nanodrop으로 농도를 측정했을때 260/280, 260/230 값도 나오고(purity는 안좋게 나왔긴 합니다) 농도도 측정이 됐습니다. 그런데 real time pcr시에 증폭이 안돼서 agarose gel에 RNA를 내려봤더니 아무 밴드도 뜨지 않았습니다.   그래서 질문은 pellet이 없었던게 RNA가 추출이 안됐던거라면, RNA가 없어도 260/280, 260/230, 농도 값이 나올 수가 있나요? 제가 chloroform을 넣고 voltexing하지 않고 pipetting만 해줬는데 그래서 추출이 잘 안됐을 수도 있는건가요?   답변 달아주시면 정말 감사하겠습니다.
회원작성글 미묘  |  2021.11.02
Q. virus copy number 측정 방법이 궁금합니다..
viral RNA copy number를 구하기 위한 목적으로 Real time pcr 을 하기위한 standard Curve를 제작하기 위해 먼저 클로닝을 하려고 하는데요. copy number 측정 자체를 아예 처음 해봐서 1. 원하는 유전자를 삽입하기 위해서 클로닝을 할때 t7 promoter가 있는 vector를 이용하려고 하는데 상관 없나요? (promoter가 필요한거죠?) 2. 그리고 유전자의 경우 꼭 full sequence를 삽입해야 하는건 아니죠?   -target gene을 plasmid에 cloning -plasmid DNA 추출 -realtime PCR을 통해 plasmid vector기반으로 10-fold serial dilution 하여 DNA copy number 계산  (standard curve 제작) 위의 방법이 virus copy number를 측정하는 것이 맞을까요?
회원작성글 soor  |  2021.10.23
Q. 나노드랍 결과가 -는 무엇을 의미하나요?? 첨부파일
안녕하세요. RNA isolation 한 후, 나노드랍을 찍었는데 -값이 나왔습니다. 이것은 무엇을 의미하고 어떤 과정에서 잘못 된건지 알 수 있을까요??   그래프상 패놀이 남아있어서 그런거라면 다시 패놀을 제거할 수 있나요??
회원작성글 세라민B  |  2021.10.21
Q. RNA 추출시 pellet washing step에 대한 질문
안녕하세요, 현재 대학원에 진학중인 학생입니다. Trizol을 이용해 RNA extraction을 진행하고 있습니다. isopropanol을 이용해 pellet을 얻어내고 75% ethanol (with DEPC water)을 이용해 washing을 진행하고 있습니다. washing 후에 ethanol은 200ul tip과 10ul tip을 이용해 제거하고, ethanol washing까지 마친 후에는 clean bench에 넣어 뚜껑을 열고 air-dry를 진행하는데요 이때 ethanol을 최대한 제거하지 않으면 air-dry과정이 너무 오래걸려서, 최대한 ethanol을 제거하고자 합니다. 그런데 ethanol 제거과정에서 pellet이 tube 벽에 딱 붙어있지 않고, ethanol과 함께 딸려오는 경우가 꽤 있습니다. (모든 pellet이 하나로 뭉쳐서 존재하지 않고, 좀 넓게 퍼져있는 느낌이 있습니다) ethanol washing을 10,000xg로 진행하고 있어서 혹시 이를 더 높이면 괜찮지 않을까 해서 washing 과정을 12,000xg 까지 높여서 진행해보기도 했는데 역시 마찬가지로 pellet이 ethanol과 함께 딸려오는 경우가 있더라구요, 그래서 제가 궁금한 부분은 1. RNA pellet이 ethanol 제거 과정에서 딸려오지 않게 하는 방법이 있는지 2. 차라리 pellet이 딸려오면, ethanol을 좀 넉넉히 남기고 제거하는 방법도 생각을 해봤는데 이럴 경우 잔여 ethanol을 빠르게 dry 하는 방법이 있을지 입니다. 답변 부탁드리겠습니다! 감사합니다.
회원작성글 학생  |  2021.10.07
Q. RNA extraction 후, 다시 extraction이 가능한 지 궁금합니다.
안녕하세요. 석사 2학기 차 초보 연구원입니다.    이번에 mouse liver에서 RNA extraction 진행하였는데 Nano drop에서 260/280nm 값이 2.01~2.03 나온 sample이 있어 purity에 문제가 있음을 알고도 크게 차이나는 게 아니라고 생각해서 ㅠㅠ cDNA~real time PCR까지 진행했는데 이 sample만 GAPDH값이 크게 차이가 나더라고요.. 그래서 혹시 정량 문제일까 싶어 정량을 다시해서 다시 cDNA 합성을 하고 PCR을 진행했는데 같은 결과가 나와서.. ㅠㅠ   사실 다시 liver에서 부터 RNA extraction을 진행하면 되겠지만 sample을 아끼고 싶은 마음에 질문 드리고 싶습니다.  한번 RNA extraciton 후, 65'C에서 5min동안 끓인 sample도 centrifuge 돌려서 pellet 생성 후, 다시 ethanol washing 단계를 거치면 purtiy를 좀 더 높일 수 있을지 궁금합니다.  감사합니다 :)  
회원작성글 김자  |  2021.10.06
Q. RNA가 적게 뽑인 후 cDNA합성
평상시 RNA isolation을 하면 500ng/ul정도 나왔는데 20ng/ul정도 밖에 나오질 않았습니다. 추후에 RT-PCR 진행 예정인데 cDNA합성할때 20ng/ul으로도 합성이 가능할까요??
회원작성글 세라민B  |  2021.08.19
Q. THP-1 cell에 PMA처리
THP-1 cell에 PMA처리한지 72h 지났는데요 PMA처리 오래할 수록 세포에게 안 좋나요?
회원작성글 디구지키미  |  2021.08.05
Q. cell 종류에 따라 rna extraction 수율이 달라지는 이유
안녕하세요 현재 퀴아젠사의 rna mini kit으로 rna extraction 하는 중인 연구원입니다. 이번에 rna-seq 위해서 rna를 뽑고있는데 어떤 세포는 찰떡같이 rna 농도도 높고 잘 나오는데 어떤세포는 rna 값도 너무 낮고 특히 260/230 값이 0.8 ~1.5 사이로 나옵니다. 제조사의 트러블 슈팅에서는 에탄올 워시가 덜 되면 260/230 값이 낮아지고, spin colum 용량 과부화, lysis buffer 양의 과량 사용인 경우 rna 농도가 낮아진다고 되어있어서 그 내용을 반영해서 protocol을 수정했고 a,b 셀은 좋은 순도로 뽑혔습니다. 그런데 오늘 여러 종류의 세포를 같은 confluency일 때 harvest하고 rna kit extraction을 같은 타이밍에 진행했는데 a,b 셀은 여전히 잘뽑히고 나머지 c,d 셀은 rna 농도가 100이하, 260/230 값은 0.9~1.8로 나왔습니다. (260/280은 2.01~2.06) 상황이 이렇다보니 잘안나오는 셀들이 근본적인 상태가 문제인건가 싶긴한데..... cell thawing 이후에 또 신경쓸 수 있는 부분이 어떤게 있을까요?ㅠㅠ
회원작성글 rornfl  |  2021.07.20
Q. 담배에서 RNA 추출했는데 Pellet이 하얗게 남아요
저희가 담배에서 TRIzol, Chloroform, Isopropanol을 이용하여 RNA 추출을 진행하였습니다. 처음 이 방법대로 진행을 했을 때 튜브 밑에 pellet이 생겼는데 너무 하얗더라고요, 분명 물을 넣었는데도 불구하고 녹지 않았고요..  저희 박사님 중 한분께서 이건 담배에서 나오는 polysaccharide이다 라고 말씀을 하셨는데, 다른 박사님께서는 절대 아니라고 말씀하셔서 뭐가 맞는 것인지 잘 모르겠습니다.  그리고 RNA 추출 후에 nanodrop을 이용해 측정했을 때 230/260 값 또한 0.8~1.1 정도로 매우 낮았습니다.  감사합니다. 
회원작성글 MSlIFE  |  2021.07.20
Q. RNA 정량 계산식이 왜 이런지 알려주실 분...ㅠㅠ
안녕하세요. 1년차 대학원생입니다.   지금 PCR RNA추출을 하고 있는데요, 프로토콜에서 75% EtOH로 씻어주고 다 말린 뒤 15~20ul DEPC 를 넣으라고 나와있습니다. 그런데 저는 cell이 적어서 10ul를 넣습니다. 그 뒤 RNA 정량을 합니다. 저희는 spectradrop을 사용해 plate reader기에서 RNA 정량을 하는데, 계산 엑셀 파일이 따로 존재합니다. 그런데 RNA ug/ul 계산식이 260nm x 40 x 20 x 2로 되어 있습니다.  40은 RNA의 상수값, 20은 stectra drop 0.5mm cover glass여서 곱해주는데 남은 2는 희석배수인지 ... 그럼 왜 2인지 아시는 분이 계신가요? 그리고 10ul 을 넣었을 시 20ul을 넣었을 시 ug/ul 농도가 달라지는게 맞는데 계산식을 바꿔야 하는데 어떤식으로 수정해야 하는지 몰라서 여기에 여쭈어 봅니다 ㅠㅠ  
회원작성글 Crea  |  2021.07.13
Q. soil rna prep 첨부파일
안녕하세요. 저번 글에서도 rna 추출에 대해서 여쭤봤엇는데 오늘은  다른 문제로 도움을 받고싶어서 이렇게 글을 올리게 되었습니다.    저는 논 토양에서 sampling 을 진행하고 , 바로 드라이아이스 + 에탄올로  얼려준 후에 실험실로 돌아와서 딥프리저에 보관하였습니다.  보관해둔 토양을 퀴아젠 soil kit 에 따라서 진행하였습니다.      이때 프로토콜의 10 step 후에 rna 펠렛은 명확히 잘 보입니다.  눈으로 확인이 가능할 정도요 . 그런데  그이후의 과정에서 JetStar Mini Column 에 염용액을 먼저 처리하여 컬럼을 적셔주고, 샘플을 binding 해줍니다.  그리고 다시 염용액을 넣어서 워싱해주고요. 빠져나온 용액은 버리고  필터를 새로운 튜브에 끼워서 일루션 용액을 넣어줍니다  그 뒤에 rna 침전을 위한 용액을 넣구요 . 그럼 원심분리 후에 rna 펠렛이 보여야 하는데 , 보이지 않고  농도 또한 낮게 관찰이 되어집니다.    혹시나 해서 원심분리 한 sup을 버리지 않고 e-tube에 담아 뒀엇는데  sup에서 rna 농도가 더 높게 나옵니다. 또한 JetStar Mini Column 에서 빠져나온 용액에서도 rna농도가 매우높게 관찰이 되어집니다.  (물론 둘다 purity는 좋지않아요) 확실하지 않지만 잘 모르는 저의 판단에는 step 과정에서  rna 가 온전히 다 회수가 안된것 같은데 .. 그럼 어떻게 해야할까요 ? ..  1. 원심분리전에 -30도에서 rna 침전 시키는 과정을 over night 한다.  2. JetStar Mini Column에서 10초 정도의 원심분리 과정을 거친다 . 3. 프로토콜에 따라서 ph7 짜리 phenol/chloroform/isopropanol 용액을 사용했는데,  ph4 phenol/chloroform/isopropanol 으로 바꾸어서 프로토콜을 진행한다. (실리카 컬럼인 JetStar Mini Column에서는 acidic해야 binding이 잘 된다고 하더라구요)     어떤 방법이 좋을까요 ? 부디 알려주세요 ㅠㅠ 혹여나 토양 rna 추출을 하시는 분이 있으시다면 꼭 .. 답변 부탁드리겠습니다ㅠㅠ 
회원작성글 끄덕끄덕  |  2021.07.08
Q. 코로나19 RNA추출
코로나19 PCR 하기 전 핵산추출과정에서 나오는 산물이 mRNA가 맞나요 코로나는 ssRNA로 구성되있다고 알고있는데 추출과정에서 뽑아내는게 mRNA면 바이러스가 숙주안에서 mRNA를 발현시켰기 때문에 가능한건가요?
회원작성글 당떨어진다  |  2021.07.07
Q. phenol/chloroform/isoamyl alcohol 첨부파일
안녕하세요. 저는 total soil rna 추출을 진행하고 있습니다. 6번 프로토콜 대로 가장 위에 있는 물층을 따서 15ml tube에 넣고 , SR3용액을 1.5ml 첨가하여 진행하였는데 원심분리 후에 펠렛이 보이지 않았고 나노드롭 결과 역시 확인해 보니 rna 추출이 이루어 지지 못했습니다.  제가 첨부한 사진에서 저는 1번 층만을 따서 SR3와 믹스 후 원심분리 하였는데요.  혹시 RNA가 다른 층에 존재하고 있는거지 여쭤보고자 글을 올리게 되었습니다. 제가 이해를 잘못 하고 있는것인지 물어볼 사람이 없어 너무 혼란스럽습니다.    phenol/chloroform/isoamyl alcohol 은 PH 4 아닌, 6.5-8 사용 하였으며  지표 시약이 들어가 있어 노란색 시약입니다.    도와주세요 ..ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 
회원작성글 끄덕끄덕  |  2021.07.03
Q. RNA크기
안녕하세요.  RNA isolation 을 하고 Gel을 내려봤습니다. 제가 알기론 28S는 4kb, 18S는 2kb가 나와야되는데 제가 내린 RNA는 28S가 10~12kb가 나오더군요. 몇번 해봤는데 할 때마다 저런 결과가 나오는데 Heavy chain이 없는 것과 관련이 있을까요?
회원작성글 뭘로하지  |  2021.06.30
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