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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA
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Q. 제한효소 반응
안녕하세요  제한 효소 반응을 통한 클로닝 과정에 궁금한 점이 있어 글을 남깁니다. 제가 기존에 두 종류의 enzyme을 사용하였을 때 버퍼 조성이 맞아서 두 enzyme을 동시에 반응을 시켰는데요, 요번에 사용하고자 하는 enzyme들은 동시에 반응 시키지 못해 한번 반응시키고 끝나면 다른 enzyme으로 반응 시켜야 할 것 같습니다. 그럼 이때 한번 enzyme으로 자르고 나서, gel purification을 하고 또 enzyme으로 자르는 것인가요? 아니면 enzyme 반응이 끝난 샘플을 원심분리해서 상층액을 제거한 다음 다른 enzyme(+ buffer)를 넣어 반응시켜주는 것인가요?   제가 생각하기엔 하나의 반응이 끝나면 그 tube안에는 DNA+buffer+DDW로 인해 volume이 많을 것 같은데 아무래도 그 tube에 다시 enzyme과 buffer를 넣어주는 것은 아닐거 같아서 여쭈어봅니다. 답변을 위해 시간 내어주셔서 감사합니다.
회원작성글 pasg1345  |  01.12
Q. Flag tag gene 확인하는 법 알려주시면 감사하겠습니다!
안녕하세요 이번에 Flag tagging된 protein을 연구하고 있는데 실험실 내에 이미 만들어진 Flag X(protein) vector가 있더라구요 근데 Transfection 시 Flag도 안뜨고 Protein도 차이가 없어서 Vector에 문제가 있는지 sequencing을 하고 싶은데 (물론 Transfection의 문제가 있을 수 있음) Vector transformation 후 miniprep하여 protein에 관해서 sequencing을 요청했을 때, 맞는 결과를 얻었는데, 혹시 Flag를 sequencing 요청할 수 있나요?? 그렇다면 primer를 어떻게 짜야 할까요??
회원작성글 수끼리  |  01.12
Q. 플라스미드 전기영동 후 결과 질문 첨부파일
사진은 플라스미드 추출 후 전기영동한 사진입니다. 맨 끝에는 농도가 다른 bp이고, 가운데는 pGLO로 끌어낸 gm109입니다. bp가 10000보다 위에 놓여서 결과가 나왔는데 이는 플라스미드 크기가 크다는 의미인가요?
회원작성글 Restoria  |  01.11
Q. enzyme 처리 시 mixture만드는거랑 따로 넣는거랑 차이가 있나요?
enzyme 처리 할때 엔자임, 버퍼, dw 를 mixture를 만들어서 넣는거랑 따로 따로 넣는거랑 차이가 있을까요?
회원작성글 닝내임  |  01.11
Q. 플라스미드 추출 첨부파일
아래 첨부 파일은 pGLO 플라스미드를 전기영동해서 추출한 결과입니다. bp가 10000보다 조금 위에 위치해서 결과가 나왔는데 이는 플라스미드 크기가 크다는 의미인가요? 그렇다면 제한효소 처리 후 다시 확인해보면 되나요?
회원작성글 가갸날  |  01.10
Q. 프라이머 보관..
안녕하세요..이번에 학부연구생 시작한 사람입니다. 착각해서 프라이머 이틀정도 실온보관 했는데 다 깨졌을까요..??
회원작성글 asdsas  |  01.10
Q. cloning 실험 순서 질문
안녕하세요 클로닝 실험 순서에 대해서 여쭤볼려고 합니다. overlapping을 통해서 만든 insert를 cloning 하려고 하는데요. 순서가 맞는지 궁금해서 여쭤봅니다. (insert) pcr purification -> enzyme cut (overnight) -> gel extraction (vector) enzyme cut (overnight) -> CIP 처리 (2hr) -> gel extraction ligation (insert,vector) RT 2~3hr 혹은 16도 overnight -> E.coli transformation
회원작성글 분자생물학도  |  01.10
Q. 핵산 혼성화 질문있습니다.
서로 다른 유래의 단일가닥 DNA가 상보적으로 결합하여 이중가닥 DNA를 형성하는 것이 혼성화잖아요?    제가 이해한 것이 맞나 궁금합니다.   1) 5'-ACGACCTATGCT-3' 라는 서열이 있다고 가정해보면요,   위 서열과 정확히 동일한 상보적 염기를 가질 확률은 1/4^12 라는 어마어마하게 낮은 확률인데,   핵산 혼성화라는 것은 이렇게 극도로 낮은 수학적 확률을 극복하고 일어나는 현상인가요? 아니면 혼성화가 잘 일어나는 서열길이가 있나요?       2) 두 가닥의 서열이 서로 100% 일치해야하나요? 아니면 아래처럼,   3'-TGCTGG[T]TA[G]GA-5'     괄호안의 염기처럼 상보적이지 않은 염기가 몇개 섞여 있더라도, 대다수의 염기와 상보적일 경우 2개의 가닥이 서로 결합하여 혼성화를 할 수 있나요?   감사합니다.
회원작성글 홉스굴  |  01.09
Q. 실험생물의 유전자 cloning시 sequence가 다를때 어떻게들 하시나요 ??
 안녕하세요, Gene cloning시 NCBI database와 나의 실험생물에서 꺼낸 유전자의 sequence가 애매하게 다를때 어떻게들 하시나요 ??  예를 들어, nucleotide 한개가 바뀌어있어서 amino acid가 한개 바뀐다거나 하는 경우가 더러 있더라구요..   또 다른 경우는 Gene을 cloning한 vector clone 3 개 정도를 sequencing 하였을 때, 각각의 clone의 유전자 염기서열이 다를 때도 있더라구요 이런 경우에는 다들 어떻게 하시는지 문득 궁금해서 질문드립니다.   읽어주셔서 감사합니다. 오늘도 행복한 하루되시길 바랍니다. 
회원작성글 Anchovy  |  01.09
Q. HPLC Grade Water 구매처 질문
안녕하세요. 저희가 PCR에 이용할 HPLC grade water 구매처를 찾고 있는데, 1L, 4L 등 대용량으로 판매하는 곳밖에 존재하지 않아서 질문드립니다. 혹시 10ml, 20ml 등 소량으로 판매하는 곳을 아시는 분이 계시다면 답변 부탁드리겠습니다. 감사합니다!
회원작성글 Rise  |  01.09
Q. cDNA로 qPCR 하실 때 보통 합성하고 어느정도까지 사용해보셨나요?
조직에서 RNA 추출 후 cDNA 합성까지 하여 보관해두었습니다 합성 직후에 qPCR 하였을 때에는 그룹간 mRNA 발현 정도가 10배 가까이 차이 났었는데 몇 달 지나고 확인할 것이 있어 다시 실험해보니 Control 군이랑 차이가 나지 않는 결과가 나오네요...  GAPDH Ct 값도 대략 1~2 cycle 정도 차이가 보입니다. 혹시 cDNA 합성 후 qPCR 수행하실때 최대 얼마나 보관한 cDNA로 실험해보셨는지 여쭤보고 싶습니다... -20도씨에 얼려두고 녹여본 적 없는 샘플들인데 갑자기 결과 재현이 안되니 RNA 추출부터 다시 시작해야할거 같아 머리가 아프네요. 제가 알고 있기로는 cDNA 합성 시 dsDNA로 보관가능하여 -20도 냉동 상태로 1년 정도 사용이 가능한걸로 알고있는데 잘못 알고 있는걸까요?   이번 실험에 사용한 샘플은 합성 후 약 5~6개월 가량 뒤에 사용하였습니다.
회원작성글 1q3e5t7u!  |  01.08
Q. 8 well multi-pipette 와 호환되는 gel comb + tray
안녕하세요?    저희 랩에서는 현재 많이들 사용하시는 머피드 제품을 사용 중인데요,  대체로는 만족하지만 멀티채널파이펫과 호환이 안 돼서 불편하네요.    혹시 호환되는 제품, 특히 젤 콤과 트레이를 추천해 주실 수 있으실까요?   감사합니다.
회원작성글 Starlove  |  01.07
Q. 재조합 DNA 플라스미드 만들때 유전자서열 첨부파일
  가운데 자주색 부분이 플라스미드에 삽입하고자하는 외부 DNA인데요 자주색 부분 양 옆을 보면, 벡터에 삽입을 하기 위해   점착성 말단과 상보적인 서열이 달려있습니다.(5' -> 3' AATTC)   근데 한 가지 의문점이 생겼습니다. 넣고자하는 외부DNA 서열 옆에 AATTC가 우연히 달려있을 확률은 1/4^5인데   저 조건을 만족시키는게 어렵지 않을까요?   아니면 제가 뭔가 잘못 이해하고 있는 것인지...   제대로 이해하고 있는 것이 맞나요?
회원작성글 홉스굴  |  01.07
Q. gel extraction 질문드립니다
gel extraction을 진행할때 UV에 비춰보면 제가 원하는 size에서의 band와 밑에 훨씬 더 두꺼운 band가 뜨는데요. 원하는 사이즈의 band를 자르는건가요? 밑에 로딩되어 내려온 두꺼운 사이즈의 band를 자르는 건가요?
회원작성글 분자생물학도  |  01.07
Q. 전기영동 밴드 끌림
mosue genotyping과정에서 전기영동으로 genotype을 확인하고 있습니다. 2-3년간 잘 확인하던 밴드인데 어느 순간부터 밴드 끌림이 심해져 밴드를 확인할 수가 없습니다.  이렇게 나오던 밴드들이 어느 순간 이렇게 되더니 이젠 이렇게 되었습니다.  primer정보나 pcr 정보(Tm, pcr cycle 등)는 마우스 판매하는 잭슨에서 받은 것이기 때문에 문제가 없을 것이고,  같은 마우스에서 다른 유전자 primer로 pcr을 하면 밴드가 잘 나옵니다.  taq을 새것으로 바꾸는것, primer stock에서 다시 희석해서 사용하는 것은 다 시도해 보았습니다.  무엇이 문제일까요?    제가 생각하고 있는 원인은 1. stock primer 오염?  2. TAE buffer이상(하지만 다른 유전자는 잘됨) 3. 전기영동 시간이 너무 길다? (마커만 보고 마커가 잘 벌어질 때 까지 내리니까 45분정도 내립니다) 이중에 문제가 있을까요?  아니면 다른 문제가 있는 걸까요? 도움 주시면 감사할 것 같습니다. 
회원작성글 _leah_  |  01.06
Q. E.coli com cell에는 자체 plasmid가 존재하나요..?
E.coli에 자체 plasmid가 존재하지 않나요? 그럼 com cell에는 자체 plasmid가 존재하는 상태로 cloning 과정을 통해 vector를 삽입하는 건가요? 아님 따로 처리를 한 후에 사용을 하는 건가요?
회원작성글 말하는걈쟈  |  01.05
Q. Real time PCR GAPDH증폭 질문
안녕하세요? Real time pcr관련하여 질문드립니다ㅜ 기존에 잘 나온던 방법대로 진행하였는데 이번에는 결과가 안나와서 의견을 여쭤보고자 합니다. 진행한 방법은 아래와 같습니다. 마우스 피부100mg을 TRizol을 이용해서 RNA를 prep하였고, 나노드롭 측정결과 3000~4000ng/ul의 RNA를 얻었습니다. 순도도 모두 정상이었습니다. Pure water를 사용하여 250ng/ul로 정량하였고, 정량한 RNA 8ul와 takara의 RT 시약3ul를 이용하여 cDNA를 합성하였습니다. 이후 pure water 200ul를 이용하여 cDNA를 희석하여주었습니다. 희석한 최종 cDNA의 농도는 50ng/ul~80ng/ul사이였습니다. Real time PCR을 진행하기위해 cDNA 3ul와 SYBR 5ul 1picomol의 (F+R) primer 3ul를 well에 넣어 총11ul의 volume으로 real time PCR을 진행하였습니다. 시험군은 normal군과 질병이 유도된군 입니다. Normal군에서는 GAPDH가 발현이 확인되나 질병군에서는GAPDH가 확인 되지 않습니다ㅜ RT가 잘못되었나 싶어 RT도 새롭게 진행해보았는데 똑같네요.. Housekeeping gene이 이럴수가 있는지 모르겠네요ㅜㅜ 기존과는 다르게 primer를 nature에 사용된것으로 변경하긴 했습니다만.. 이문제는 아닌거 같은데 방법적으로 잘못된 부분이 있을까요? template양의 과다 부족 등등.. 감사합니다ㅜㅜ
회원작성글 RTO1  |  01.04
Q. snapgene에서 squencing한 insert 합치는 방법
pGEM -T Easy vector에 insert 넣어서 cloning해서 sp6, T7으로 squencing했습니다.   그래서 파일을 받았는데 snapgene에서 vector랑 insert 부분을 연결해서 하나의 파일로 만드는 방법을 모르겠습니다.     squencing파일이랑 원본이랑 alignment해서 확인은 했는데 합치는 방법을 모르겠습니다. 혹시 어떻게 하는지 아시는분 계실까요??
회원작성글 근당근당  |  01.04
Q. PEI/DNA complexation 관련 [speed님 과 선배님들 부탁드립니다]
  안녕하세요,  제가 궁금한 것은  PEI와 같은 transfection reagent 를 DNA와 complexation 시킬 때  N/P ratio를 구하는 것입니다.  제 기억으로 단순하게 사용하고자 하는 PEI(25kDa)의 amine 수 와 DNA(pCDNA3.1 plasmid vector)의 phosphate 수라고만 알고 있습니다.  관련 논문을 찾아보는데,  이런식으로 계산을 하는 논문을 찾았습니다.  하지만 밑에서 예시로 든 NP ratio 12를 만들기 위한  DNA 1ug 과 PEI 4.2ug를 formula에 대입을 하면 12가 나오지 않습니다.  제가 뭔가 착각을 하고 있는 것인지... 선배님들의 조언이 필요합니다.    감사합니다.
회원작성글 Vaydor  |  01.04
Q. 제한효소로 컷팅했을 때 gel에 내려보면 아무것도 없습니다. 왜 그럴까요?
안녕하세요. 제가 DNA cloning을 진행하고 있는데 문제가 생겨버렸습니다 ㅜ 먼저 자르지 않은 DNA를 Agarose gel 에 내려보면 각각의 위치에 뜨는 것을 확인할 수 있는데 이것을 제한효소로 컷팅만하면 흔적도 없이 사라집니다. 즉, 제한효소로 컷팅시 gel어디에도 흔적을 찾을 수가 없고 오직 마커만 보이는 상태입니다.  혹시나 해서 다른 사람이 해보기도 했는데 결과는 마찬가지였습니다.   1. 혹시 왜 그러는 지 이유를 알고 계신 분 있나요??   2. 이걸 해결하려면 어떻게 해야할까요?
회원작성글 bio1296  |  01.04
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