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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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Q. 보존료 실험 중 내부표준물질의 RT변화에 대해서 질문드립니다!
안녕하세요. 식품중 보존료를 검사하고 있는 일을 하고있습니다. 식약처에서 제시한 방법에 따라서 프로피온산을 GC로 분석을 하고있습니다. 표준품(프로피온산), 내부표준물질(크로톤산)은 아세톤에 희석하여 분석하고 시료같은 경우는 추출용매가 에탄올입니다. 그래서 그런지 GC분석을 하면 표준물질의 프로피온산, 크로톤산의 RT와  시료의 프로피온산, 크로톤산의 RT가 조금 차이가 납니다.ㅠㅠ 에탄올에 녹인 시료를 분석할 때의 RT가 표준품보다 살짝 밀립니다.  RT를 맞추고 싶은데 혹시 해결할수 있는 방법이 있을까요? (GC컬럼은 FFAP를 사용합니다.) 도움부탁드리겠습니다!
회원작성글 둥배누나  |  09.22
Q. Dna methylation 확인 실험 계획
고등학교 1학년이고 학교에서 예산을 받아 dna 메틸화 관련 탐구를 진행하려고 합니다 그래서 dna methylation 확인 실험을 해보려고 하는데 검색을 해봐도 방법을 찾지 못하겠어서 질문을 하게 되었습니다 Dna methylation 확인 실험 중 bisulfite conversion 로 계획하고 있습니다! 방법이나 혹은 참고할 만한 사이트 있으면 알려주시면 감사하겠습니다
회원작성글 다음  |  09.22
Q. iPSC 배양용 Essential 8 배지 써보신분
fibroblast로 episomal reporgramming 해서 ips를 만드려고 하는 중인데요.   episomal reprogramming kit를 이용하는데 여기 protocol에 essential 8 media를 쓸때는 37도에서 데우지 말고 상온에 둬서 찬기가 없어질때까지 두라는데 이렇게 사용하는게 맞는건가요?   "Before use, warm complete medium required for that day at room temperature until it is no longer cool to the touch. Do not warm the medium at 37°C."   주말에도 나와서 배지교환해줘야 하는데 37도에서 데우기 없이 상온에서 두려면 시간이 꽤 걸릴것 같아서요ㅜㅜ   essential 8 배지 사용해보신분 계시면 이렇게 사용하셨는지 37도에서 데워도 상관없는지 궁금합니다.
회원작성글 him  |  09.22
Q. cystal violet이 옷에 묻었는데 어떻게 지우나요?
gram-staining 하다가 crystal violet이 옷에 튀었는데 알코올로 지우면 지워질까요? 다른 글 보니까 오래 세탁하다보면 연해진다고는 하던데 알코올로 하면 좀 효과 있으려나요?? ㅠㅠ
회원작성글 빈가루  |  09.22
Q. rt-qPCR prep과정 시 rna추출량이 너무 적어요ㅠ
안녕하세요 rt-qPCR prep을 하고 있는데 RNA추출량이 너무 적게 나와서 문의드려요.. 일단 24well plate에 RAW 264.7 cell을 10^4cells/ml씩 seeding한 후 단백질을 treat 한 후 5일 째 되는 날 prep 진행하였습니다. prep 과정은 아래에 적어놓았습니다. 1. RiboEx 1ml을 넣고 피펫팅을 하여 세포를 회수한 후 Chlroform 200ul씩 넣고 볼텍싱하여 4도에 15분 두기 2. 13000g , 15min centrifuge 후 상등액 200ul 만 isopropanol 500ul에 넣고 4도에 15분 두기 3. 다시 13000g, 15min centrifuge 4. 펠렛을 제외하고 나머지는 피펫으로 빨아들이고 75%에탄올을 600ul넣고 13000g, 15min centrifuge를 하여 워싱 (이 과정 3번 반복) 5. 피펫으로 나머지 알코올 최대한 제거 후 Ep tube 뚜껑 열어서 말려주기 6. 50도에 히팅한 NFDW를 6ul 정도 펠렛이 들어있는 튜브에 넣고 잘 mix하여 나노드랍찍기   control군과 물질처리한 군을 비교해 보기 위해 진행하였습니다. control군의 RNA양은 800ng/ul정도 나오는데 treat한 군의 RNA양은 80~90ng/ul정도로 너무 적게 나와서요. 260/280값과 260/230값은 모두 정상범위안에 들어왔고, treat한 군의 세포를 현미경으로 확인하였을 때는 죽어보이진 않았습니다. 10번정도 진행했는데 거의 같은 결과가 나와서 핸들링 문제는 아닌 것 같아요.. 조언 부탁드립니다ㅜㅜ
회원작성글 asgacaew  |  09.22
Q. PCR melting curve peak 관련 질문 드립니다.
안녕하세요. PCR 진행 중 primer peak 관련해서 질문 드립니다.   현재 저희가 선배 실험을 그대로 재현하는 중이어서 예전에 사용했던 primer와 같은 sequence로 제작하여 사용 중입니다.  근데 타겟군에서는 melting curve peak가 1개로 일정하게 나오는데 nc군에서는 melting curve peak가 일정하지 않고 다른 쪽에서 1 peak를 찍거나 2 peak를 찍는 경우가 있습니다. 전에 실험했던 선배는 primer 문제는 없다고 했습니다. PCR cycle은 95도 10분 preheat 후 95도 15초 -> 60도 15초 -> 72도 30초로 40 cycle 진행하였습니다. primer의 TM값은 58도입니다. NC 군의 melting curve이고 타겟군의 melting curve 입니다.   PCR을 여러번 진행했는데 매번 같은 결과가 나왔습니다. 재현 실험이라 primer 교체는 최후로 생각하고 있습니다.   답변 주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 anfakfen  |  09.22
Q. 균 TEM negative staining 관련 질문 드립니다.
안녕하세요. 저희는 균 겉에 붙어있는 exosome을 촬영하고 싶어서 TEM 촬영을 하고 있는데 균을 negative staining하면 염색약 (uranyl acetate)를 정말 짧게 (올렸다가 바로 흡수시킴) 해도 너무 까맣게 나오네요ㅜㅜ   sample 5 ul loading 후 1분 방치 -> blotting -> 2% uranyl acetate staining (20 ul, 1초) -> blotting -> drying 이 방법으로 negative staining 진행했습니다. 이게 저희가 찍은 사진이고 위 사진처럼 나오길 원합니다.   감사합니다.
회원작성글 anfakfen  |  09.22
Q. sonication, Ni-NTA 첨부파일
Ni-NTA agarose (Qiagen)으로 protein purification하고 있는 대학원생입니다. 실험실에서 처음으로 재조합 후 단백질 발현을 하고 있는데 궁금한 점이 있어 올립니다. <protocol> 1. 200mL LB broth (AP100) OD600: 0.5-0.7 incubation 2. 0.1mM IPTG, 30℃, 150rpm, 6h induction 3. 원심분리 및 supernatant 제거 (-80℃ 보관) 4. 20mL lysis buffer (50mM NaH2PO4. 300mM NaCl, 10mM imidazole) 5. Lysozyme 1mg/mL incubate on ice for 30min 6. Sonication (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 30회) 7. 원심분리, supernatant 및 pellet 보관 8. Ni-NTA slurry 1mL 원심분리 및 supernatant 제거 9. 2mL lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl) mix (inverting) 10. 원심분리 및 supernatant 제거 11. 20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker) 12. lysate-Ni-NTA micture column으로 옮긴 후 bottom cap 제거하여 flow-thrugh 수집 13. 2.5mL washing buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole)로 2번 진행 및 수집 14. 0.5mL Elution buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole)로 4번 진행 및 수집 15. BCA assay, SDS-PAGE <질문> 1) 50mL culture로 sonicaiton (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 20회) 조건으로 충분히 파쇄되고 약간 투명해지는게 확인됐습니다. 하지만 200mL culture는 기존 조건으로는 덜 투명해져서 sonication 횟수를 30회로 늘렸는데 더 좋은 방법이 있을까요? 횟수가 늘어나면 좋지 않다고 들어서요.. (현미경으로 관찰하면서 cell 파쇄됐는지 추가로 확인하고 있습니다.) 2) SDS-PAGE 결과, Elution 쪽에 목표 단백질인 약 30kDa 외에도 여러 band가 떴습니다. 이에 교수님은 Ni-NTA에 protein을 붙이는 과정에서 잘못된거 아니냐고 하셨는데 '20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker)' 반응을 더 늘려야 할까요? 3) 약간 바보같은 질문일 수 있는데 혹시 protein genE size가 855bp인데 kDa으로 환산하면 30kDa이 맞을까요?.. 사이트랑 기존 계산법으로는 30kDa으로 나오는데 교수님은 70kDa이라고 하셔서요..
회원작성글 구릅  |  09.22
Q. PCR Buffer 관련해서 질문드립니다.
안녕하세요. Pcr을 하는데 buffer에 10x 라고 쓰여있고 (TP)라고 적힌 것이 있는데 무엇을 의미하는걸까요?
회원작성글 HuiJ  |  09.22
Q. Protease 역가 계산 질문드립니다.
안녕하세요. protease assay 효소액 88ml중 120ul 채취하여 사용하였습니다. 실험방법은 효소액 120ul와 azocasein 480ul를 80분 동안 반응시킨 후 20% TCA용액 600ul로 섞고 원심분리하였습니다. 그리고 위 용액중 100ul와 sodium carbonate 500ul, Folin-Phenol 버퍼 100ul를 30분 동안 반응시켜 660nm에서 흡광도를 측정했습니다.   이때 역가 계산은 (시험용액 중 티로신양(ug/mL) x 88ml x 1.2ml)/80min x 0.12ml 로 계산하는게 맞나요?
회원작성글 gythakssmd..  |  09.22
Q. Cell homogenate의 glycerol assay kit를 cell media에 써 보신 분 있을까요?
안녕하세요 3T3-L1 분화 실험 중인 대학원생입니다....  다름이 아니라, 지금까지는 분화 끝내고 oil red o로 분화 정도를 확인하였었는데 이번에는 cell media의 glycerol을 측정하여 비교하려 합니다.  추천받은 키트의 프로토콜을 확인하니 cell homogenate를 이용하는 게 실려있던데, cell media도 같은 방식으로 실험해도 괜찮을까요? 괜찮다면, serum free 배지 같은 걸 48시간 정도 처리하면 glycerol이 충분히 나올까요..?   감사합니다.
회원작성글 버티기  |  09.22
Q. CLSM 형광 파장대
Excitation 484 nm, Emission 501 nm Excitaion 549 nm, Emission 565 nm  CLSM에사 다음과 같은 형광 파장대를 보려면  Dye를 각각 뭐로 설정해 놓고 보는게 좋을까요??
회원작성글 안뇽,  |  09.22
Q. 포자 pcr
포자가 형성된 상태의 균은 pcr이 잘 되지 않는 이유가 무엇일까요?
회원작성글 새보  |  09.22
Q. NAA녹이는방법이 궁금합니다
callus를 유도하기 위해서 NAA를 녹여서 사용하려고 하는데 사람들마다 말하는 게 달라서 어떤 사람은 NaOH로 녹이라는 분이 있고 어떤 분은 DW로 녹이라는 분이 있어서 어떤 걸로 어떤 방법으로 녹이는지 알려주세요 ㅠㅠ
회원작성글 plant phys..  |  09.22
Q. LPS 추출 실험에 대한 질문이 있습니다.
안녕하세요. 박테리아의 LPS 추출 실험 중 질문이 있습니다. LPS 추출을 위해 박테리아를 overnight으로 키우고, 희석시켜 cell 수를 맞춘 후 phenol-water 추출법을 사용하였습니다. cell을 harvest하여 washing하였고, DW를 넣고 100도에서 15분 정도 끓여주었습니다. 그 후 68도로 incubation한 hot phenol을 넣어주어 vortexing 한 후 centrifuge하여 상층액만 추출하였습니다. 추출한 상층액에 pH 5.2 NaOAc를 넣고 에탄올을 넣어준 후 -20도에서 하루 incubation 시켰는데, 그 후 용액을 아무리 centrifuge를 돌려도 pellet이 생기지 않습니다ㅠㅠprotocol대로 정확히 따랐는데..혹시 제 방법에 무슨 문제가 있는지 알려주실 분 계실까요?? 정말 이유를 모르겠습니다.. 도와주시면 정말 감사하겠습니다ㅠㅠ!!
회원작성글 사람살려  |  09.22
Q. transgenic plant 전기영동 관련 질문
transgenic plant(T) T1에 대한 전기영동(선발을 위한) 결과 single band가 나와야 한다 하는데 이유가 궁금합니다. 또한 hetero시 전기영동 결과가 2개의 band로 나타나는데 염색체 관련인지 아니면 다른 이유인지 궁금합니다. (멘델의 유전 법칙, hetero, homo, 염색체 등 관련)
회원작성글 5년  |  09.22
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