안녕하세요 연구원분들   분자생물학관련 질문이 있습니다.    전사된 mRNA가 단백질로 번역될 때,   1. 번역 후 mRNA는 재활용되어지나요 또는 분해되나요?    2. mRNA 내부에 개시코돈/종결코돈 즉, ORF가 2개 이상 존재하면  그에 맞게 단백질도 2개 이상이 합성되나요?    답변 부탁드립니다. 

E.coli protein overexpression 실험에서 마지막에 cell sonication하고 원심분리 한 뒤 상층액을 soluble, pellet에 buffer 파이펫팅한 후 insoluble이라고 라벨링 하는 것까지 실험을 진행하였는데 soluble과 insoluble의 정확한 의미와 거기에 들어있는 것, 그리고 그 둘의 차이점은 무엇인가요?? 실험 내용을 정확히 이해하지 못한 채 실험을 진행하여서 그대로 따라하긴 했는데 레포트 작성하려고 하니 어려운 점이 많네요.. 도와주세요!ㅜㅜㅜ

안녕하세요.   100mg 시약이 있는데,  solubility H2O: 10 mg/mL, clear 라고 나와있습니다.   500mM stock으로 만들고 싶어서 시약 전체를 600ul에 완전히 녹여 사용하였는데, 문제가 될까요?? 

안녕하세요. 단백질 발현 및 정제 실험을 진행하고 있는 대학원생입니다. 다름이 아니라 단백질 발현시 일반적으로 18도에서 induction 시간을 오버나잇으로 잡으시는 것 같은데 혹시 그 이상 (48시간 이상) 진행시 단백질 활성에 문제가 있을까요? 단백질 발현양이 적어 48시간으로 늘려볼까 생각 중에 있는데 구글링을 해보니 단백질 활성에 negative effect가 있다고 뜨더라구요.. 어떤 문제인지 찾아보고자 했는데 잘 안 나와서.. 혹시 어떤 영향을 주는건지 알려주실 수 있으실까요? 감사합니다.

1. 이 실험을 진행 할 때 negative control을 만들어 같이 흡광도를 측정하였는데, negative control을 만드는 이유는 무엇인가요? 2. negative control을 만들때 BSA를 사용하였는데, 이외에 negative control을 만드는데 사용 할 수 있는 물질이 무엇이 있나요? (kinase 제외)

안녕하세요 단백질 발현 확인하고 있는 석사생입니다. 이번주에 sonicator로 cell을 파쇄해서 내부 단백질을 용출시킨 후 target 단백질 발현을 확인하기 위해 SDS-PAGE를 진행하였습니다. 첫번째 사진은 지난주에 성공적으로 SDS-PAGE를 진행하였을 때 PM2700 marker의 band 양상입니다(lane 2번) 제 target 단백질 분자량이 142kDa인데 3번 lane, 4번 lane에서 각각 Ni-NTA 및 amylose purification을 진행한 sample을 loading했을 때, 잘 정제된 것을 확인할 수 있었습니다. 이번주에 Ni-NTA purification한 결과 단백질 정제가 거의 이루어지지 않아서, sonicator로 cell lysis 진행한 후 centrifuge로 insoluble(4번 lane), soluble(3번 lane)로 나누어 target단백질이 존재하는지 여부를 확인해 보았습니다.(2번째 사진) 그런데 (두번째 사진에서) marker의 band 간격이 조금씩 어긋나 보이고 그로 인해 band 위치가 지난번과 조금이지만 다르게 나타난 것 같습니다. 저 정도 차이는 무시해도 되는 걸까요? 첫번째 사진에서 marker band 별 분자량을 표시했던 선들을  두번째 사진에서 marker의 1번째 band에 맞춰서 그대로 적용해 보았는데 band 위치가 살짝씩 이상하고 마지막에 10kDa, ~5kDa은 나오지도 않은 것 같아서요! 혹시 문제가 있는 걸까요?   또 cell lysis결과 제 target 단백질이 나오지 않은 것으로 보이는데, 이 경우는 단백질 발현이 되지 않았다고 보는 게 맞는걸까요? 아니면 제가 sonicator 오사용(너무 많은 횟수 진행 및 probe 깊이가 너무 깊었습니다.)으로 cell lysis가 제대로 이루어지지 않은 것 같다고 교수님께 피드백을 들었었는데 그 때문에 cell 내에서 단백질이 제대로 나오지 못했거나 degradation으로 저분자화 되서 다른 band에 산발적으로 위치해 있다고 해석해야 할까요?   감사합니다.    

안녕하세요. 논문을 이제 막 시작하고 있습니다. 기초도 엄청 부족하지만... 두 군의 Telomere length차이가 유의미한지확인하는 실험인데 샘플맡길 회사 결과가 길이 3~4 kb, 3.5 입니다. 이런식으로 나오더라구요. 사실 단일값이 나오면 쉬운데 실험값은 오차가 생기기 마련이라 두군을 비교해서 통계자료를 얻으려면 결과값이 range로 나오면 비교가 곤란할거같습니다. 혹시 어떻게 처리하시는지..

안녕하세요 바이오 고수님들께 궁금한 답을 찾고자 이렇게 글을 쓰게 되었습니다!   저희 실험실에서는 지금까지 CRISPR/Cas9 system을 이용해서 여러가지 Knock-out cell line 제작을 했었습니다. 이 때 plenti CRISPR cas9 ver2 벡터를 이용했고, 만든 벡터를 (sgRNA 넣어준 벡터)  Electroporation방법으로 세포 내에 벡터를 넣어주고 puromycin selection을 해서 K/O cell line을 제작을 하는 방법을 사용했습니다.  1. 궁금한 점은 electroporation 방법으로 세포 내로 pLenti CRISPR cas9 plasmin 1개만 넣어주었는데 이 벡터가 어떻게 chromosome 내로 insertion이 될 수 있는지? (plenti CRISPR cas9 plasmid vector 내에 PuroR sequnece가 있음. 5'LTR, 3'LTR 사이에 gene이 있다고 해도 Integrase가 있어야지 세포 내로 Integration이 될 수 있는 것이 아닌지? ) (LTR에 integrase binding 서열이 있는 것이지 integrase 가 있어야지만 integration 될 수 있는 것이 아닌지?)   2. 이러한 물음을 가지게 된 계기가 .. pCW57-GFP-2A-MCS 벡터 (All-in-one doxycycline inducible lentiviral vector for expression of one gene in combination with turbo GFP using the P2A self-cleaving peptide.) 를 이용해서 Target gene을 Inducible 하게 발현하는 세포를 만들고자 하였는데, 이 벡터1개를 세포 내에 Electroporation해서 넣어 주었는데 세포가 잘 만들어지지 않아서 논문들을 찾아보니 대부분 Virus infection 방법을 이용해서 (packaging vector와 같이 HEK293T에 먼저 transfection) 세포를 만드는 것을 확인 하 였습니다. K/O cell line을 만들 때 plenti CRISPR cas9 벡터 1개만 electroporation해도 cell line이 잘 만들어졌기 때문에 pCW57-GFP-2A-MCS 벡터도 동일하게 넣어준 것인데 혹시 문제점이 있는 것인지 궁금합니다..! 답변 주시면 정말 감사할 것 같습니다.. 대학원생 분들 모두 화이팅 입니다!  감사합니다.    

안녕하세요! 동남아지역 식물상 연구하는 박사생입니다. 조만간 해외 출장으로 현지에서 식물 잎 샘플링 후 연구실로 가져와 DNA 추출해보려 준비중입니다. 운반시에 비행 등 소요시간도 길어, 어떻게 보관해야 품질저하 없이 안전하게 랩으로 가져올 수 있을까 고민중입니다. 좋은 방법이 있으시면 소개 부탁드립니다~!

cell selection할 때, Hygromycin B 항생제가 잘 안드는데 보관 조건을 잘 못 맞춰서 일까요?   Hygromycin B 저항 유전자, GOI 삽입된 cell을 select하면서 키우는 중인데 최근에 저항유전자와 GOI가 없는 cell들이 많이 관측되네요 자연 뮤테이션되어서 저항 유전자 삽입 안된 cell들이 Hygromycin에 죽어야하는데 안죽어서 ㅜ.ㅜ 이전에는 잘 됐었습니다. 제 생각에 항생제 문제라고 생각이 됩니다.  사용하는 제품은 50mg/ml liquid 형태이고 그동안 항생제 사용한지 2년 정도 되었고, 보관할 때 뚜껑 없이 냉장고 보관하고 온도도 2~8도씨가 아닌 10도씨 정도에서 보관을 하긴 했습니다. 이런 부분이 문제가 됐었겠죠? 항생제를 새로 교체하면 문제가 해결이 되겠죠?  

blue-white screening 실험을 하고, 각각의 white colony와 blue colony에 primer와 Taq polymerase, dNTP, F.R primer, DW를 넣고 PCR을 진행하였습니다. blue colony의 경우 plasmid에 insert DNA가 들어가지 않아 생긴것이고, white colony의 경우 plasmid에 insert DNA가 들어가 생겼는데 왜 전기영동 결과 white colony에서는 band가 확인되고, blue colony의 경우 band가 확인이 되지 않는건가요? 전기영동에서 보이는 band에는 insert DNA 외에도 plasmid DNA가 있으니 white colony 뿐만아니라 blue colony도 band가 보여야 된다고 생각합니다...   1. 전기영동 결과 보이는 band는 앞서 말한 DNA를 모두 다 포함하고 있는건가요? 2. 왜 white colony를 전기영동하면 band가 보이는데, blue colony를 전기영동하면 band가 보이지 않는건가요?   감사합니다.

LB BrothㅡNaCl,trypton,Yeast 로 제조하는데 Trypton대신 Pepton써도 되나요?

선생님들 질병유도물질을 용해하는데 독성관련해서 문의드려요 DMSO 는 통상적으로 1~2%대이하면 세포 컨디션에 지장이 가지않는다고 알고있습니다. 다만 이번에 메탄올로 용해하는게처음이라 메탄올은 어느정도 퍼센트까지 낮춰야 세포에 영향을 끼치지 않을지 알수있을까요? 감사드립니다

gel extraction 진행후 ratio까지 확인했습니다. ratio는 잘나왔지만 6ng/ul 나왔습니다.  너무 적은거 같아서요 cloning 실험 하는데 최소 몇 ng 까지 있어야 하는지 알려주시면 감사하겠습니다.!  

저번 실험에서 t-vector와 ligation을 해서 새로운 vector를 만들었습니다. 그 vector에 insert DNA가 잘 들어갔는지 확인하는 실험을 했습니다. Colony에서 white와 blue colony를 각각 넣은 pre-mix를 PCR 진행해주었는데, PCR을 진행하는 이유가 뭔가요? 그리고 white colony를 넣은 pre-mix를 전기영동해주면, band가 나오는데 blue colony를 넣은 pre-mix를 전기영동해주면, band가 나오지 않더라구요 만약 insert DNA가 삽입이 되면 lacZ가 발현되지 않아 b-galactosidae가 분비되지 않아 x-gal이 분해되지 않아 white colony가 생성 되는 것까지는 이해가 되는데 왜 전기영동시 band가 나오지 않는건가요?

40% 아크릴아마이드를 30%아크릴아마이드로 농도를 낮춰 실험을 하고 싶습니다.   그이유는 SDS-page 조성표가 대부분 30% 아크릴아마이드에 해당하는 농도이며, 계속 진행해왔던 아크릴아마이드 농도는 30%이기 때문입니다.   40%아크릴아마이드를 전체농도에서 1/4만큼의 아크릴아마이드를 사용하면 동일한 결과를 얻을수 있지만 30%으로 농도를 낮춰 진행을 하고 싶습니다. 괜히 농도가 바뀌었다는 이유만으로 실험에 영향이 가지 않을까 걱정이 되기도 해서요 ㅠㅠ    이경우 아크릴아마이드 40%와 DDW(auto clave 하지않은) 3:1 로 희석을하여 잘 섞어주면 30%아크릴아마이드가 되나요?