bioactive 펩타이드로 NO assay 를 하고 있습니다.  실험조건은  96well에 10만개, RAW264.7, LPS 1ug/mL, 샘플-LPS 동시 처리후 24시간 배양하였고, 사용된 배지는 phenol red 포함한 DMEM입니다. 결과를 말씀드리면,control에 비해  LPS를 넣은 경우 NO 생성이 5-8배 증가하였습니다. 문제는 처리한 펩타이드 (~500ug/mL)의 NO 저해가 전혀 효과가 없었습니다.  Q1. phenol red가   griess시약의 발색과 유사하여 phenol red없는 배지를 써야 한다는 말이 많던데, 생각해 보면  LPS를 처리하지 않은 control에도 phenol red가 들어가기 때문에 굳이 phenol red가 안들어간 배지를 사용해야 할까요? Q2. 문헌에서 10ug/mL에서 항염 효능이 있다고 되어 있는 펩타이드인데도 500ug/mL 에서조차 전혀 저해능이 없었습니다. 뭐가 문제일까요?  LPS에 의해 RAW cell이 activation되어 끄덕도 없는걸까요.. 이 펩타이드를 positive control로 생각하고 진행한건데,, 전혀 효능이 보이지 않아 당황스럽습니다. 혹시 positive control로 사용하는 항염 펩타이드가 있다면 추천 부탁드립니다.    

직접 NO assay를 해본 적은 없고 다른 연구소와 cowork으로 항염 활성을 평가하고 있습니다.  그런데 첫번째 연구소과 두번째 연구소에서의 활성이 많이 다릅니다. 비교해 보면 정말 큰 차이는 없는데,,,,제가 프로토콜을 분석해본 결과 다음과 같은 차이가 있습니다. 물론 다른 cell 상태, LPS 상태도 다를 것이라 생각됩니다.   1. 96well에 6만개 RAW264.7cell, LPS 100ng/mL   -NO 생성 저해능100ug/mL에서 65%    2. 96well에 10만개 RAW264.7cell, LPS 1ug/mL  -NO 생성 저해능100ug/mL에서 20%  입니다. 상당한 차이가 있는데요..   혹시 LPS가 10배 차이가 나는데, LPS 대비 샘플의 농도가 낮아서 효능이 낮게 나올수도 있을까요?   그리고 phenol red있는 DMEM을 사용하는 경우, griess assay에 크게 영향을 미치나요? control, +LPS, +LPS+ 샘플 모두 같은 조건이니 괜찮지 않을까요?  

기존에 H&E 염색 하려고 만든 파라핀 블록이 있는데, 며칠 안된 것부터 2년 된 것까지 있습니다.   지금 3번정도 약 1-2년된 파라핀 블록을 다시 절삭해서 IHC를 하였는데, positive control임에도 불구하고 negetive로 나옵니다.   Antigen retrieval 이 안된건가 생각해봐서 primary antibody 농도를 좀 올려서 했는데도 negative로 나오고..     1. 오래된 블록이라서 그런 가능성도 있나요? 2. 한번에 슬라이드를 많이 깎아놓고 4도씨 보관했다가 꺼내서 신전기에 올려두었다가 진행할 때도 있는데, 신전기에 12시간 이상 두었다가 실험하는 것도 영향을 미칠까요?   제가 IHC가 메인인 업무가 아닌데다 주변에 IHC를 하는 사람이 거의 없어서 positive control에서 조차 이런 결과는 당황스럽습니다ㅠ

안녕하세요 브릭에서 많은걸 질문하고 얻어가고 있는 석사1년차입니다.   최근 단백질 처리후 투과를 보기위해 ICC를 진행하고있습니다.  진행하는 방법은 1. cell Fixation 2. 0.25% Triton X-100 (in PBS)으로 30분 3. PBS or PBS-T로 5회 washing 4. 3% BSA sol. (in PBS-T)로 blocking 1시간 5. 3과 동일하게 washing 6. 1% BSA sol. (in PBS-T)에 1st Ab (250:1) 첨가. 4℃에서 O/N 7. 다음날 3과 동일하게 washing 8. 1% BSA sol. (in PBS-T)에 2nd Ab(Alexa488)(500:1) 첨가. 암실, RT에서 반응 1시간 9. 3과 동일하게 washing 10. DAPI (in PBS) 1000:1(혹은 2000:1까지 희석가능) 이용해 암실에서 1분(넘기지 않게) 반응 11. washing 3회   진행하고 있습니다. 제가 사용하는 단백질은 T7tag와  6x histidine이 달려있어서 먼저 t7으로 진행했는데 컨트롤에서도 거의 유사하게 형광이 잡혀서 이번에는 histidine으로도 진행해봤으나 역시 컨트롤에서도 나와 매우 곤란한 상황입니다. 단백질에 대한 항체는 아직 보유하고 있지않은데 원래 이게 일반적인 세포에서도 나오는거라 구매를해서 진행해도 같은결과가 나올까 주문을 고민하고 있습니다. cell은 HDF로 진행하고 있습니다... 혹시 뭐가 잘못된걸까요...?확인은 형광형미경으로 진행하엿습니다..

조직에서 부터 면역세포를 확인 하고자 하려고 합니다.   근데 조직 슬라이드가 한정이 되어있어서 세포마다 targeting 하여 IHC로 보기가 어려 울거 같습니다.   전반적으로 면역세포만 염색하는 방법이 있는지요?

항염증 연구와 관련된 논문들을 살펴보다 보니 많은 식물들이 항염증 효과와 항산화를 둘 다 갖고 있고, 심지어는 항암 효과도 가지고 있는 경우가 많더라구요 개념을 찾아봐도 많이 헷갈려요.. 항산화와 항염증, 항암은 어떤 관계가 있는 건가요? 항염증이 있으면 무조건 항산화 효능, 항암효능이 있다고 봐도 되는 건가요?

제가 지금 breast cancer tissue와 breast cancer cell에 human igg를 negative control로 사용하고 있습니다. human igg가 facs(ihc와 동일한 antibody사용)에서는 binding 하지않는데 ihc에서는 binding이 너무 잘됩니다. 제 이론상으로는 아예 염색이 하나도 되지 않아야 하는데 이유가 무엇일까요? 제가 논문을 좀 찾아본 결과로 paraffin block을 만들면 조직이 소수성이 높아져 igg의 fc부분을 비특이적으로 결합을 시킨다고 알려져 있습니다. 이게 문제인건가요? 현재 개발하고 있는 antibody가 정확하게 붙었는지 확인 할려면 negative가 필요할 것 같은데 다른걸 써야하나요? 개발하고 있는 antibody가 mouse에서 생성한 antibody인데 그럼 ihc 할 때 mouse igg를 사용해서 비교해야하나요?

안녕하세요. ICC 처음 진행하게 돼서 그와 관련하여 여쭤볼게 있습니다.   약물의 시간별 처리에 따라 Mitochondria에서의 2가지 항체가 co-하는지 확인하고자 하는데요.   Q1. Blocking 후에 1차항체 A (Host M) 와 1차항체 B (Host R)를 처리할 때,    1) 1차항체 A 넣고, RT 1hr and washing 후 B넣고 RT 1hr and washing        또는    2) A와 B를 같이 넣은 후, 4도 O/N 후 washing       어떤 방식으로 하는게 좋을지요?   Q2. 2차항체도 A와 B에 대해서 시간을 두고 넣어야할까요, 아니면 동시에       넣고 진행해도 상관없을까요?   Q3. 위의 1차와 2차 항체 붙이는 과정 끝난 후에 mito-tracker로 최종 염색         하면 될까요?   답변해주시면 고맙겠습니다 :)  

IHC할때 Antigen retrival 시에 95"로 끓이잖아요   이때 전에 한번 끓인 citrate buffer 재사용 가능한가요?

  PBMC 분리과정에서 마지막 washing 하고 cell down 후  상층액 석션할때 suction기의 흡입력이 약해서, 상층액을 그냥 따라버려도 괜찮을까요? cell들이 많이 떨어져 나갈까요? 허접한 질문 죄송...  

B cell과 T cell의 상호작용에 대해 아시는 분 있나요 교수님께서 문제를 주셨는데 Th cell과 B cell의 상호작용은 알겠는데 T cell과의 상호작용은 잘 없네요 ㅠㅅㅠ T cell안에 Th cell이 있다는건 알겠는데 교수님이 T cell과의 상호작용을 물어보셔서,,,, 도와주세요!

아무 처리도 하지 않은 RAW 264.7 cell도 griess 시약 투여시 분홍색으로 변했다면 cell의 어떤 점이 문제가 생긴 건가요?

griess assay에서 griess A 시약과 griess B 시약을 시험 직전에 섞어주는 이유가 있나요? (미리 섞어놓고 쓰지 않는 이유)

Primary antibody : F4/80 Antibodies, Bio-rad, MCA497G Secondary antibody : Goat anti Rat IgG2b:HRP, Bio-rad, STAR114P Vectastain : ABC KIT, Vector labs, PK-6100 DAB : DAB Quanto, thermos scientific, TA-125-QHDX 사용하였습니다 Liver 조직슬라이드 deparaffinzation 후 antigen retrieval 후에 블록킹> 3% h202 10min, goat serum 20min incubate 하였습니다. Primary antibody : F4/80 Antibodies, Bio-rad, MCA497g로 24시간 o/n 하였습니다. 다음날 Vectastain : ABC KIT, Vector labs, PK-6100 으로 30분 incubate 후에  Secondary antibody : Goat anti Rat IgG2b:HRP, Bio-rad, STAR114P 부착하였습니다. Scientific Ultravision Substrate Detection System (DAB) 처리 후 hemotoxylin 염색하고 마운팅하여 확인하였는데 호가인이 안됩니다. 무슨 문제인지 알고싶습니다. 키트들은 전부 새거로 사용하였습니다.

EDTA tube에 혈액 채취후 PBMC를 분리하려 하는데 1. 혈액 채취 후 몇시간이내까지 안정성이 있나요?여건상 샘플을 모아서 오전/오후 분리를 하려하는데 yield가 많이 차이나는지 궁금합니다.분리 된 PBMC로 CD34를 분리하거나, TCR sequencing, FACS 분석 등에 사용 하려합니다. 2. 또 PBMC 분리 전 혈액 샘플 (EDTA) 보관 온도도 궁금합니다. (냉장보관인지 상온보관인지)3. 또 헤파린 튜브가 아닌 EDTA 튜브의 PBMC분리 안정성도 궁금합니다. 답변 부탁드립니다.

ICC 실험하시는 석사/박사 분들 혹시 ICC 용으로 사용하시는 과산화수소수가 뭔지 답변 부탁 드려도 될까요?