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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. western blot image J 정량
안녕하세요. Western blot을 통해서 MAPK(ERK1/2, P38, JNK1/2)를 보고 있습니다. 다름이 아니라 ERK1/2나 JNK1/2같은 경우 2개의 밴드로 나오는 Antibody를 가지고 실험을 하고 있는데에 있어서, Image J로 정량을 하는데에 고민이 있습니다. 2가지 밴드를 한꺼번에 잡아서 정량을 해야하는 것인지, 아니면 1개의 밴드(EX  : JNK1, JNK2 따로 ERK1, ERK2 따로) 잡고 값을 더한 후(JNK1+JNK2, ERK1+ERK2) 정량해야 하는 것인지 궁금합니다.. 특히 JNK 같은 경우는 잡밴드가 심해서(JNK2와 JNK1 사이에 밴드가 나옵니다) 어떻게 정량을 해야할지 잘 모르겠습니다.. 도와주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 HT22  |  08.02
Q. Western Blot 시 Ponceat Staining 정량
안녕하세요! Western Blot 실험중인 대학원생입니다. 이번에 처음으로 Ponceau Staining  정량을 하게되었는데 어려워서 질문 올려요!  저희가 지금 하고있는 방법은 프린터 스캔과 휴대폰 촬영 후 Image J 프로그램을 이용해서 정량하는데 손을 많이 타는 것 같고 정량값이 일정하지가 않는 문제가 있습니다. 정확한 다른 방법 있으시면 알려주세요,,,!!부탁드립니다!    
회원작성글 으논  |  08.02
Q. western blot 실험 중 특정 protein lane이 줄어듦니다..
western blot 실험 중인 대학원생입니다 몇 주 전부터 특정 protein lane이 좁아집니다. 이유를 아시는 분 있나요...?
회원작성글 뉴트리아  |  08.01
Q. western total form / actin
western하면 보통 p form, total form, actin을 찍는 것으로 알고 있는데 total form과 actin이 어떤 점이 다른지 궁금합니다 ㅠㅠ
회원작성글 엄청난초짜  |  07.31
Q. 잘나오던 western 결과가 자꾸만 이상하게 나옵니다ㅠㅠ 첨부파일
선생님들 안녕하세요. 이번에 쥐의 liver, SP을 이용해서 웨스턴을 계속 진행하고 있는 대학원생입니다. liver와 SP을 로딩해서 웨스턴을 진행할때마다 (계속 같은 샘플을 이용했습니다.), 잘 나오던 housekeeping gene들이 이번주 내내 웨스턴 결과에서 7/29에 나와있는 필름 사진처럼 나오지도 않고, 폰슈 염색도 자꾸 이상해서 굉장히 답답합니다..ㅠㅜ 혹시 계속 이렇게 나오는 이유는 샘플이 갑자기 잘못된 걸까요...?? 아니면 러닝버퍼들이 갑자기 이상해진걸까요...?? 필름 사진들 모두 15ug으로 로딩했었고, 샘플들은 -20도에서 계속 보관했었습니다!
회원작성글 뿡빵스  |  07.29
Q. Western blot 항체
단백질 두개의 상호작용 알아보려는데 ip해서 단백질 한개는 나왔는데 다른 단백질도 찾으려고 합니다. 1차 항체로는 a-flag 쓰고 2차항체로는 a-dgk 쓰는데 순서가 잘못되었나요? Ip후 wb 하고나서의 순서 아시는분 계실까요? 초보라서 어려운데 사수는 알아서 하라고 하시니..
회원작성글 바닷가  |  07.28
Q. western detection 문제
어제 detection을 한 membrane을 오늘 확인차 다시 detection을 하려고 보니깐 어제보다 band가 더 희미하게 나오는데    stripping 해서 1차 ab부터 다시 해야 결과가 제대로 나올까요? 이런 경우는 처음이라 당황스럽네요 ㅜㅜ membrane은 TBST에 넣어서 냉장보관 하고 있다가 오늘 detection하려고 꺼내서 해봤는데 밴드가 어제보다 옅게 나오네요 ㅜㅜ   어제 봤을 땐 2차까지 붙여서 바로 본 결과였습니다..!! 혹여나 protein이 씻겨져 나가거나 그러진 않았을까요?
회원작성글 열두시삼십분  |  07.28
Q. western blot 실험 결과 double band로 나올 때
안녕하세요, 제목 그대로의 질문 드립니다. Western blot 실험 결과로 band를 봤을 때 double band가 뜨는 경우 어떻게 하시나요?  Protein marker와 비교했을 때 가장 정확한 위치에 뜨는 band만을 실험 데이터로 쓰시나요, 아니면 두 band 모두 데이터로 활용하시나요? 논문을 봤을 때는 후자의 경우는 못봐서 트러블슈팅을 해서 어떻게든 단일 band만을 얻어낸건지 double band에서 한 band만을 선택해서 데이터로 쓴건지 알 수 가 없는것 같아요.. 두 band 중에 한 band만이 내가 원하는 단백질이라고 한다면 1차, 2차 antibody를 붙였을 때 한 곳에만 붙는게 맞을텐데 두군데 모두에서 붙었다면 둘 다 제가 보려는 단백질이라는건지,, 아니면 쪼개져서 전기영동 된건지 (이 경우도 얼추 가능성있어보이는게 확실히 아래쪽에서 뜨는 band는 좀더 옅고 위에 뜨는 band와 굵기변화가 유사해서요),, 어떻게 생각하시나요? 의견남겨주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 experiment  |  07.28
Q. Cytosol fractionation을 western 단백질 sample 만드는 법이 궁금합니다.
안녕하세요.   western으로 오늘도 고통받는 대학원생입니다.   혼자서 실험 복기 중에 생각난게 cytosol fractionation을 이용한 western blot을 하는 분들을 논문으로 보게 되어 질문드리게 되었습니다. 성상이 pellet 같은 기타 fractionation은 ripa 나 등등 넣어 protein sample을 만들었었지만, sample로 부터 ultra를 돌리고 바로 나온 cytosol fractionation은 어떻게 단백질 sample을 만드는 지 궁금합니다.   그냥 단순히 cytosol fraction (liquid) 을 BCA 후, 농도에 맞춰 5x sample bf와 물을 넣어 western sample을 만들면 되는건지, 아니면 cytosol에 5x sample bf만 넣어줘도 되는건지 궁금합니다.      
회원작성글 kodo2001  |  07.27
Q. western blot 고수 분들 답변 부탁드립니다.. 첨부파일
안녕하세요. 혼자서 계속 고뇌하며 실험 중인 대학원생입니다..   mouse urine 을 사용하여 약 26 kda 정도 되는 단백질을 western blot을 활용하여 확인해보려고 하는데... 첨부한 사진(15% gel)처럼 urine 부분만 전개가 되질 않습니다. 옆에 positive control은 잘 나오구 있구요...   원래 urine 특성이 gel %와 관계 없이 running이 되질 않는건지... 아니면 제가 sample 만드는 방법이 잘못된건지... 어떻게 해야 제가 원하는 band를 안정적인 protocol로 해서 확인이 가능할 지 여쭤보고 싶습니다.   선배님들 진심으로 답변 부탁드립니다.   감사합니다. 
회원작성글 kodo2001  |  07.26
Q. 세포에 단백질 처리
안녕하세요!    세포에 특정 단백질을 처리하여 western blot을 진행하고자 합니다.  논문에 의하면 cell seeding -> serum starvation -> drug treat -> protein treat 의 방법으로 진행하여야 하는데,  약물 처리 후 배지를 걷어내고 protein을 희석해놓은 배지로 교환해도 되는건가요?  아니면 약물 처리 된 배지를 걷어내지말고 protein을 바로 treat 해야되나요
회원작성글 졸려요  |  07.25
Q. protein의 upregulation을 뒷받침 해줄 수 있는 실험 방법은 어떤게 있을까요?
proteinA가 proteinB를 dose dependent하게 upregulation시키는 경우 다음으로 해볼 수 있는 실험방법이 있을까요?  time dependent, chx처리, mRNA 발현 확인 이외의 실험 방법이 있나요?
회원작성글 Dozmal  |  07.25
Q. western blot 1차 항체 관련 질문입니다!
제가 어떠한 단백질을 암호화하는 DNA 시퀀스를 vector에 cloning 하고, E. coli 에 transformation 후 IPTG 이용해서 과량 발현, 이후 His-tag과 Ni-NTA resin을 이용해서 타겟 단백질을 정제했는데요,   해당 protein이 제대로 발현되어 정제된 것인지를 확인하기 위해서, 먼저 SDS PAGE를 내려본 결과 원하는 kDa 크기로 나왔습니다.   좀 더 확실하게 확인하기 위해, western-blot 이용해서 타겟 단백질을 검출하려고 하는데요,   이 때 1차 항체를 어떻게 구해야 하나요? 즉, 제 단백질은 흔한 단백질이 아니고 제가 specific한 sequence를 cloning 해서 만든 단백질인데, 해당하는 amino acid sequence를 업체에 알려줘서 1차 항체 제조를 의뢰해야 하는건가요?   그렇다면 일반적으로 어느 업체에 의뢰를 많이 하나요?   읽어주셔서 감사드립니다!    
회원작성글 따릉릉  |  07.23
Q. transfer buffer 제작시에 ethanol대신 methanol을 사용해도 되나요?
transfer buffer 제작시에 ethanol대신 methanol을 사용해도 되나요? 두가지 모두 transfer시에 Protein이 membrane에 잘 결합하도록 해주는 역할로 알고 있습니다.
회원작성글 탱탱볼  |  07.21
Q. treatment시 none에 넣을 시약
protein extration 하기 전에 cell에 treatment를 하는데 none에는 treatment stock할때 희석한 용액을(EX. DMSO, PBS) 동일한 양을 넣어주는걸로 알고 있습니다. 제가 treatment를 3가지 사용하는데 한가지는 DEPC로 희석하고 한가지는 PBS (0.1%BSA 첨가), 다른 한가지는 DMSO로 희석하였습니다. 그리고 media에 첨가되는 용량도 다 다른데 이런경우네는 none에는 어떤 시약을 얼만큼 넣어야하나요?  
회원작성글 oneday  |  07.21
Q. IP 수행중인데 궁금한 점이 있어서요~~
안녕하세요, 석사 진행중인 학생입니다. 현재 primary cell line에 tagged protein을 overexpression 시킨 다음에, coIP및 Western blot으로 interaction을 보고 있습니다. overexpression시킨 HA-A 단백질과 primary cell의 B 단백질간의 interaction을 본다고 생각할 때,   몇가지 질문이 있는데요, 1. input 과 coIP sample을 western으로 보여줄때는 모두 같은 membrane에 위치해야하나요? 일단 제 생각으로는 밴드 노출시간이 달라지기 때문에, 반드시 같은 membrane 위에 input 및 sample이 있어야한다고 생각합니다. 그런데 input과 sample을 따로따로 보여주는 데이터도 있더라구요, 이래도 괜찮나요? 2. input 과 co-IP sample을 같이 보여준다고 할 때  IP가 너무 잘되어 input 및 co IP sample을 같이 현상하면, ecl pico를 이용해서 진행함에도 불구하고, B 단백질이 input에는 너무 적고, IP sample에서는 너무 많습니다. 노출을 줄이면 input에서 안보이고, input이 보이면 IP sample이 가운데가 하얗게 나오는 ghost 현상이 계속 발생하고 있습니다. 이를 해결하는 방법이 있을지요...? 현상은 film이 아닌, 기계를 이용해서 하고 있습니다.      
회원작성글 신입입니다  |  07.20
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