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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Differentiation/Proliferation
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Q. Flt3L을 이용한 Bone marrow cell culture (Dendritic cell 생성)를 아시는 분 계실까요
  안녕하세요, 박사과정생으로 이번에 Dendritic cell에 대해 연구를 하게 되었습니다. 기존에 Bone marrow cell을 마우스의 정강이뼈와 대퇴부에서 isolation하여 GM-CSF를 treat하여 BMDM을 만들어 사용하는 실험은 몇번 해보아서 알고 있었고, GM-CSF를 이용한 BMDC 생성법도 알고 있었는데요,   이번에 https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.04.005 라는 논문에서 보게된 Flt3L을 이용한 BM culture방법을 사용하여 DC를 만들고 싶어, article에 있는 methods를 그대로 따라서 해 보았는데.. 완전히 실패하였습니다.   위 논문에 쓰인 protocol을 간단히 설명드리면, BM뽑아서 RPMI (10%FBS, 2mM L-glutamine, b-mercapto, Flt3L)에 3일간 culture후 3일째에 OP9 cell과 합쳐 co-culture하라고 되어 있는데요, 문제는 OP9 cell과 합치기도 전인 3일째에 cell들을 harvest하여 FACs로 확인해보니 대부분의 BMcell이 죽었다는 것입니다. BM cell의 survival에 도움을 주는 GM-CSF가 전혀 들어가지 않아서 그런것인가 추측만 할뿐인데, 논문 저자들은 어떻게 실험을 했는지 알수가 없어서...  1저자 2저자 연락처를 찾아보려고 노력도 했는데 도저히 연락할 방법이 없더군요. 3일째에 그래도 얼마 안되는 cell이라도 살아있으니까 OP9 cell과 합쳐 보았는데, 오늘 5일째 FACs를 확인해보니 조금 살아있는 cell이 늘긴 했습니다만 이 역시 너무 적습니다. 이렇게 되는게 정상인것 같지도 않고요... 혹시 이 실험방법과 관련하여 경험이 있으시거나 지식이 있으신 분이 계시다면 조언을 해주시면 정말 감사하겠습니다.   긴 글 읽어주셔서 감사합니다. 좋은하루 되세요.
회원작성글 아이이이잉  |  06.21
Q. Reprogramming에서 fibroblast가 처음 사용된 이유
안녕하세요. Yamanaka 등 cell reprogramming을 처음 성공한 사람들이 왜 다양한 somatic cell type 중에서 하필 fibroblast를 사용한 건가요? Mouse나 human에서 모두 fibroblast가 처음 사용된 것 같은데,,, 그 이유가 궁금합니다.
회원작성글 dj_hwn  |  05.27
Q. IL-13 분비 cell line 질문입니다 ㅠㅠ
안녕하세요!  IL-13 분비 cell 에서 IL-13 저하능을 확인해보려고 하는데 추천해주실만한 cell line 이 있으실까요 ㅠㅠ...
회원작성글 mingudam  |  05.27
Q. THP-1 differentiation
THP-1을 differentiation 해주기 위해서 PMA를 사용한다고 들었습니다. 그런데 PMA를 3일정도 처리해 준 후, 원하는 물질을 처리하기 전에 PBS로 washing해주라고들 하는데,   여기서 왜 wasing과정이 필요할까요? PMA가 들어있는 배지에 물질을 그대로 treat하거나 혹은, washing없이 그냥 진행하면 안되나요?
회원작성글 jjnli  |  05.22
Q. 삼중음성유방암(TNBC) 세포의 HER2
삼중음성유방암은 세포 내 estrogen receptor의 부재, progesterone receptor의 부재, HER2의 부재로 인해 치료가 매우 힘든 암이라고 알려져 있습니다. estrogen receptor와 progesterone receptor가 없으면 호르몬 치료가 효과가 없으므로 치료의 어려움이 이해됩니다. 그런데 cell proliferation을 일으키는 HER2가 없는 것이 왜 삼중음성유방암의 치료를 어렵게 하는 요인인지 잘 이해되지 않습니다. HER2가 없으면 오히려 세포 성장이 더딜 것 같은데 말이죠. 이에 대해 조언해주시면 감사하겠습니다.    
회원작성글 겅mini  |  04.28
Q. CFSE 7-AAD Staining facs 첨부파일
안녕하세요. 제가 cfse,7-aad를 이용해서 처음 facs를 진행하는데 이렇게 보는게 맞는지 알고 싶어서 글을 써봅니다.. 시간은 ohr을 제외한 나머지는 48hr을 처리한 것입니다. 저렇게 잡아서 결과를 내는게 맞는지 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 아라니다  |  04.09
Q. iPS의 trilineage differentiation이 갑자기 안됩니다..
Ectoderm (day1)     Mesoderm (day1)   Endoderm (day1)    제가 iPS로 trilineage differentiation 을 하고 있습니다.  Stemcell technologies에서 구입한 kit로 하고 있습니다.  현재 passage 17 이후부터 분화를 진행하고있는데 문제는 cell seeding 후 endoderm media를 넣으면  다음날 세포 90% 이상이 모두 떠버리는 현상이 발생합니다...   분화 메디아의 경우, 냉동으로 온 메디아를 overnight으로 녹인 후  다음날 10ml 씩 aliquot하여 다시 얼린 뒤 사용 전에 overnight으로 녹여서  사용하고 있습니다. 혹시 이게 문제일까요?    왜 endoderm media만 저렇게 90% 이상 뜨는지 궁금합니다.. 전에 passage 17 전에 할 때는 저렇게 90% 이상 뜨지 않았었어요 passage에 문제라고 생각하지는 않는데   이런 경험이 있으신 분들이 계시다면 어떻게 극복하셨는지 궁금합니다.
회원작성글 joo0085  |  04.03
Q. C2C12 분화 상태 문의
C2C12 분화 6일차 사진입니다. 사이 사이 세포 상태가 이상한 것 같습니다. 문제점이 뭔지 모르겠습니다. 조언 부탁드립니다. 2*10^5 cells/well 로 하루 배양하면 거의 꽉차고, 2% horse serum 으로 교체합니다. 배지는 이틀에 한번 교체하고 있습니다.
회원작성글 왜안돼  |  04.01
Q. 골세포 분화배지(ODM)에 들어가는 β-Glycerol phosphate 종류
골세포 분화를 위한 ODM(osteogenic differentation medium) 배지를 만들려고합니다.  이때 들어갈 β-Glycerol phosphate가 종류가 하나만 있지 않더라구요.  SIGMA 검색해보니 2가지 있던데 1. β-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate (50020/MW : 306.11) 2. β-Glycerophosphate disodium salt hydrate (G9422/MW: 216.04)   -보통 골세포 분화를 위해서 이 둘 중 어딜꺼 쓰시나요?? -제가 얻어온건 β-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate(50020/MW : 306.11)인데 이걸로 사용 해도 괜찮을까요?? 답변 부탁드립니다!!  
회원작성글 앨  |  03.31
Q. 3T3-L1 DMI 배지 제조 시
3T3-L1 지방세포로 분화시키기 위해 DMI 배지 제조하려고 합니다. [Final conc.] - Dexamethasone 0.25 uM - IBMX 0.5 mM [Stock conc.] - Dexamethasone 0.25 mM - IBMX 500 mM 1. Stock conc. 위의 농도로 DMSO에 녹일 예정입니다. 2. 분화유도시 6 well plate에 seeding할 때, 각 well 당 FBS 배지 2 ml + 제가 녹인 시약 2ul(1000 : 1)씩 넣을 계획 입니다. Q) 이렇게 계산하고 진행하는거 맞을까요? Q) 3T3-L1 분화해보신 분들은 이 과정을 어떻게 진행했는지 혹시 상세하게 알려주실 수 있나요?? 제가 대학원 들어온지 얼마 안되어서.. 이렇게 기본적인 질문을 해도 될련지..ㅜㅜ 다들 항상 수고 많으십니다..!
회원작성글 앨  |  03.14
Q. 3T3-L1의 osetocyte로 분화
혹시 3T3-L1이 osetocyte로 분화한다는 논문이나 관련 글 보신적 있으신지요..?   인위적인 방법으로 분화시키는 법 말구, 3T3-L1이 '직접' 분화하는지..
회원작성글 앨  |  03.03
Q. IBMX stock solution 농도 관련해서 질문드립니다.
안녕하세요 3T3-L1을 키우고 있는 학부연구생입니다. 다름이 아니라 Sigma-aldrich 에서 시킨 IBMX 250mg을 처음에는 500mM(1000x)로 만들기 위해서 2.25ml 에탄올로 녹였는데 잘 녹지 않길래 20.25ml을 추가로 넣어 총 22.25ml에탄올로 250mg IBMX를 녹여 50mM(100x)로 만들어줬습니다. cell 분화 유도 할때 stock solution을 100x로 만든게 문제가 될까요...?   감사합니다.
회원작성글 망고야얼망고  |  02.25
Q. 한 plate에 WST-1 여러번 진행 가능한가요?
안녕하세요. 제가 현재 WST-1 assay를 진행하고 있는데 24, 48h 을 진행을 할 예정에 있습니다. 그런데 WST-1이 독성이 없는 것으로 알고 있어서 24시간에 측정하고 media 갈아주고 48시간에 WST-1을 새로 처리하여 측정을 해도 문제가 없을까요??
회원작성글 쩝쩝석사과정  |  02.24
Q. T cell proliferation
안녕하세요, 새내기 대학원생입니다. pbmc에서 분리한 T cell로 proliferation 실험을 진행하려고 합니다. 제가 공부한 바로는, pbmc에서 분리한 T cell은 증식을 하지 않아 특정 stimulation(anti-CD3이라던지..)을 줘서 증식을 유도해야한다고 이해했습니다. 저는 media의 아미노산 조성을 다르게 하였을 때 T cell에 미치는 영향을 보려고 하는데, 이 경우에도 T cell에 자극을 준 뒤 proliferation을 측정해야하는게 맞을까요? 맞다면 선생님들께서는 주로 어떤 방법으로 하시는지 궁금합니다. 많은 답변 부탁드리겠습니다. 감사합니다.  
회원작성글 cp2c  |  02.17
Q. hacat, hs27 RNA extraction
안녕하세요 :-)  RNA extraction 위해 cell seeding 하고자합니다. 3T3 같은 경우는 100% cell 차고 분화시약을 치는데  hacat, hs27은 seeding하고 분화시약을 안치나요? 논문 몇 편 읽어보았는데 seeding 24시간 후 DPBS washing 작업 후 UVB 조사 후 보고자하는 sample 처리한 뒤 24시간 후 RNA 추출을 하더라고요..  답변주시면 너무 감사하겠습니다 !!!!!!!!!!!!!!!         
회원작성글 마시멜로핫초코  |  02.15
Q. CCK-8 proliferation 질문있습니다.
CCK-8로 proliferation을 측정하고있습니다. 식이 duration*log(2)/log(first/final)이던데 식을 어떻게 유도하는지와 각자 의미하는 것이 무엇인지 찾아보았지만 찾지를 못하여서 이렇게 질문드립니다.
회원작성글 태태태  |  02.09
Q. 0.02몰 reagent 만드는 방법
선배님... 안녕하세요. 실험 초보자입니다. 아래와 같은 물질로 reagent를 만들려 합니다. 방법 좀 알려주시면 감사하겠습니다. 아래 안녕하세요...선배님들... 실험 초보자 입니다.. 품명  ;           alpha- Glucosidase from Bacillus stearothermophilus           lyophilized power,>50 units/mg protein.           CASNumber ; 9001-42-7           효소위원회 번호 3.2.1.20(BRENDA,IUBMB)           단위 ; One unit will liberate 1.0 micromole of D-glucose from                   p-nitrophenyl alpha-D-glucoside per min at pH6.8 at 37*C.           Specipic activity ; >50 units/mg protein.            상기 물질로 alpha-glucosidase enzyme solution 2종류를 만들려고             합니다.         제품정보에는          1. Immediately before use, prepare a solution containing           0.15 - 0.3unit/ml of alpha-glucosidase in cold deionized water -           여기서 0.15-0.3/ml, 5ml enzyme solution을 만들려 합니다.         2. 0.02M, 10ml Enzyme solution을 만들려 합니다.          선배님 여러분들..        1,2번의 enzyme solution만드는 방법을 지도 부탁드려요...        감사합니다.      
회원작성글 stanley  |  01.26
Q. Thymidine incorporation assay 관련 질문입니다.
안녕하세요. Thymidine incorporation assay를 통해 proliferaion을 보려고 합니다. 랩미팅에서 실험 계획을 발표하는데, 교수님께서 Thymidine assay는 우리나라에서 이제 못하게 된 것으로 알고 있는데, 한번 확인해보라고 하셨습니다. 찾아보니, Thermo에서 Thymidine incorporation kit를 판매중인 것으로 확인되는데, (https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/angiogenesis-protocols/thymidine-incorporation-assay/thymidine-incorporation-assay-kits.html) 그럼 해당 키트를 구매해서 사용해도 될까요? 다른 분들은 어떻게 해당 실험을 진행하시는지 궁금합니다. 보통 키트를 사용하시는지, 아니면 랩마다 사용하시는 프로토콜이 따로 있는지 알려주시면 감사하겠습니다! 많은 답변 부탁드립니다. 새해 복 많이 받으세요.
회원작성글 cp2c  |  01.06
Q. 3T3-L1 cell 분화 관련 ㅠ 첨부파일
안녕하세요 저는 석사 이제 3학기차인 대학원생입니다.. 저희 실험실은 3T3-L1 지방세포를 가지고 주로(거의) 실험을 하고 있습니다. 프로토콜도 나름 잘되어있고, 실험 setting도 잘 되어있습니다. 하지만, 갑자기 잘 되던 지방세포분화가 갑자기 10월달 부터 되지 않습니다.. 저는 6월달 까지도 분화가 거의 80~90% 정도로 잘 됐어서 프로토콜에 문제가 생긴 것은 아닌 것 같습니다. 10월달부터 안돼서 Ins, Dex, IBMX, FBS, BCS 등 분화관련 혈청들을 다 새것으로 바꾸어도 보았는데 마찬가지로 지방세포 분화율이 좋지 않습니다. (30~40% 정도) 세포의 passage도 15아래로, 21년도 3월달에 ATCC에서 구매해서 사용하고 있었습니다.. 아무리 관련 물건들을 다 바꿔도,.. 예전만큼의 분화율이 나오지 않습니다..  과제 마감이 코앞인데,. 이걸 어떻게 해야할까요.. 제 손의 문제일까요..? 나름 생각해 본 것이 세포 분화를 진행할 때 Day 0을 처리할 시기가 중요한 것 같은데 저희는 24well에 세포를 seeding한 뒤 꽉 채우고 세포들이 붙어서 동그래지면 그 때 Day 0 을 처리합니다. 이 시기가 잘 못 되었을 수도 있을 것 같아서 Day 0을 처리할 때 꽉 채운 뒤 1-2일 정도도 더 유지시키고 MDI를 처리하였는데, 마찬가지로 분화율이 안좋습니다.. 과장 좀 보태서 40개의 plate정도를 분화시켰는데 매번 잘나오던 애들이 안나오니 죽을 맛입니다.. 세포 고수님들 도와주세요.. 어떤 것을 또 바꾸면 될까요..? 부탁드립니다.   첨부파일은 예전 분화한 사진과 지금 분화시킨 사진을 비교한 pdf입니다. 보시고 말씀해주세요... 
회원작성글 도덕배  |  01.05
Q. 배지에 배양한 세균 종류 좀 알려주세요ㅜ
학교에서 손 씻은 후와 손 씻기 전으로 나눠서 실험했는데 씻은 후에 해당하는 배지에 이렇게 세종류의 세균이 자랐습니다 (미색으로 얇고 넓게 퍼진 것, 검정색으로 위로 솟아오르듯 자라는 것, 작은 원모양 노랑색) 각각의 세균 종류와 만약 실험을 통해 알 수 있는 법이 있다면 알려주세요ㅜㅜ (실험으로 세균 종류 알아내는 실험은 굳이 고등학교 수준 아니어도 됩니다 그냥 보고서에 쓸 내용이라)
회원작성글 psy  |  2021.12.29
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