안녕하세요... 실험을 하다가 도저히 모르겠어서 질문드립니다... 실험시 standard -Final : 20ug/mL BSA = 1X dye 1000ul + 2mg/ml BSA 2ul 후 serial dilution 하여 1.25ug/mL 까지 만든 후 96 well 에 200ul씩 분주   Sample -unknown sample 2ul+1x dye 500uL 하여 96well 에 200ul 씩 분주합니다.    이후 추세선 값에 sample 의 od를 넣어 x 값이 나오게되는데 이후를 모르겠습니다.   제가 20ug 를 사용한다면 20/x값 이렇게 계산해야할 것 같은데 희석배수는 어디에 들어가며 이 경우 희석배수는 몇인가요..?   도와주세요....ㅜㅠ

에틸 아세테이트와 아세트산을 20:1의 비율로 혼합한 전개용매를 사용한 TLC판에 아스파르트산의 기름층을 spotting했을 때, 254nm의 UV로 비추면 보이지 않는데, 그 이유가 아스파르트산의 극성이 너무 커서인 건가요? 아니면 다른 이유가 있나요??

안녕하세요, mouse brain lysate를 이용하여 stereotaxic injection을 수행하려고 하는 석사생입니다. Brain lysate를 만들어야 하는데 궁금한 점이 있어서 질문드립니다. 여러 논문들에서 찾아낸 brain lysate의 과정은 1. Mouse에서 Brain 적출 2. Homogenize한 뒤 Sonication 3. centrifuge하고 난 뒤 Supernatant만 사용 입니다. 여기서 Perfusion은 언급되어 있지 않더라구요. Perfusion을 해서 피를 빼낸 후에 해야 하는건지, 아니면 있는 그대로의 Brain을 바로 homogenize하는 것인지 알고 싶습니다.

제가 메탄올로 물질 추출 진행 후 DW를 동량 첨가해 50% 메탄올에 녹은 상태였고 원하는 물질은 methanol이나 dmso에 녹는다고 했습니다 (dw는 안녹을 가능성이 훨씬 높아요) 이 샘플로 MS를 찍기 위해서 필터링을 했는데 아무 생각없이 CA filter류 필터했습니다ㅠㅠ 1미리를 필터했더니 절반밖에 안나오길래 1미리를 더 필터하니 1미리양이 되더라구요.. 그때 생각을 못했는데 CA 필터가 가끔 메탄올 필터 가능하다는 말들이 있던데 필터가 안된걸까요? 제가 원하는 물질이 필터에 걸려서 안나온 걸까요? ㅠㅠㅠㅠ

sds page시에 단백질 사이즈를 봐야합니다  제단백질 사이즈는 대략80~kdal정도 되는데  단백질사이즈 kdal이런거는 어떻게 계산해서 확인하면되나요  소중한 지식 공유 부탁드립니다 ㅠㅠ ! 

1. 단백질 추출할때 50% meoh로 최종적으로 녹이는 경우가 있던데 내 타겟 단백질이 메탄올에 녹는다면 50% 메탄올에도 잘 녹을 수 있는건가요? 보통 100% 가 아닌 희석한 유기용매에 단백질을 녹이는 이유가 있나요..? 질문 2. 내 단백질 샘플이 dmso에 녹아있는데 셀에 처리하기 위해 1%로 희석해준다면 dw에 녹지 않는 타겟 단백질이라고 해도 잘 녹아잇을 수 있는건가요?

단백질 정량시 약 150ug/ml농도임을 확인하고 sds를 내렸는데 레더는 보이나 샘플에서 밴드가 전혀 보이지 않습니다 ㅠ 어떤 이유가 있을까요..? 단백질 추출 과정에서 마지막에 메탄올에 녹인 뒤 원하는 농도로 맞추기 위해 50도 오븐에서 몇시간 메탄올을 날렸습니다. 이후 동량의 증류수를 첨가하여 50% meoh에 단백질이 녹은 상태가 됐습니다. 이 샘플을 정량한 결과 150이 나왔습니다. 이 샘플을 로딩하게되면 메탄올이 들어있어 로딩이 되지 않으므로 해당 샘플을 질소가스로 날려서 물만 남긴 뒤에 (이상하게 물이 든 양보다 많이 작게 남았습니다. 물도 같이 날라갈 수도 있나요? ㅠㅠㅠ) 날린 양만큼 dmso를 넣고 샘플 버퍼와 섞어 로딩했습니다. (검출하고자 하는 단백질은 meoh과 dmso에 녹습니다) 혹시 단백질 추출시 50도 오븐에 몇시간 둔 것이 문제가 될 수도 있을까요? 하지만 브레드포드 정량시 150이나 검출됐는데 sds에 전혀 뜨지 않는 게 이상합니다 ㅠ 아니면 메탄올을 날리고 dmso를 첨가하는 과정에 뭔가 문제가 있나요? 제발 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠ

안녕하세요 초보 대학원생 입니다.  현재 cell fraction을 배우는 중입니다.  trypsin 처리 이후 nacl로 wasing +centrifugation 해준 후 cell pellet만을 deepfreezer에서 얼리고 나서 12 시간 이후 cell fraction을 해도 괜찮을까요?    아니면 cell banker로 얼린이후에 nacl washing 후 cell fraction을 하는게 좋을까요? 

ion exchange chromatography를 이용해 protein을 분리한 결과 그래프를 보는데, A280값이 초반에 높은 peak가 나타나고, 그 이후로는 낮은 값에서 완만하게 나타났습니다. A280이 protein의 absorbance를 나타내는것은 알겠는데, 왜 A280을 측정하는지, 그리고 왜 초반에 높은 peak를 나타내는지 궁금합니다.

발효물의 단백질 분자량 양상을 시각적으로 확인하기 위해 SDS-PAGE를 진행해봤습니다. 추출방법은 sample buffer를 첨가후 100도에서 5분 정도 처리 후 gel에 로딩하는 일반적인 방법입니다. 저분자의 단백질 밴드를 확인하기 위해서 glycine에서 tricine buffer를 바꿔보기도 하고, seperating gel의 농도를 15%까지 올려보기도 하였습니다. 물론 정량하진 않았으나, 원물이 더 추출이 잘되었다는 것도 이해가 가지 않을뿐더러,  60kDa이상의 고분자 단백질이 발효물에서는 분해가 되어 2,30KDa의 분자량을 가진 단백질로 쪼개어졌다고는 판단이 되지만,  원물에 2,30KDa의 분자량을 가진 단백질들이 쪼개어졌다면, 발효물의 10KDa 이하의 분자량을 가진 단백질들이 보여야하는 부분이 아닌지... 또한, SDS-PAGE에서는 10KDa 이하의분자량을 가진 단백질을 관찰하기 어려운 것인지... 좀 알고 싶습니다.

사용된 프로틴 농도가 쿠마시 블루 스테이닝과 무슨 연관이 있나요?

BSA농도별로 standard curve를 구해서 만들어 보았습니다. 제가 구하고자 하는 샘플의 OD값이 0.155(blank를 뺀값= 0.043)이라서 저 그래프에 대입하여 농도를 구하고자 하였는데 -값이 나옵니다. 근데 BSA농도가 0.025mg/ml일때OD값도 0.155인데 제가 그래프를 잘못 만든 것인가요?

Cd8 t cell isolation 실험하는데 96 well plate에 미리 anti cd3를 코팅했습니다. 왜 anti cd3는 미리 코팅하고 anti cd28은 미리 코팅해두지 않은걸까요 그리고 anti cd3랑 cd3랑 뭐가 다른건지 초보라 잘 이해가 안되어서 알려주시면 감사하겠습니다.

안녕하세요 western blot을 위해 cell 혹은 조직에서 단백질 exraction 시, 여태까지는 RIPA buffer를 이용했었는데요, 단백질량이 적은것 같아 이번에는 RIPA를 쓰지 않고 아예 처음부터 laemmli sample buffer를 이용해  lysis하려고 합니다(이렇게 하는 실험실도 있다고 하길래) 저는 5X sample buffer를 가지고 있는데 1. 이를 그대로 lysis에 사용해도 되는지 아니면 1X상태로 희석해서 사용하여야 하는지 궁금합니다. 2. 희석해서 사용하여야 한다면, 무엇으로 희석해야하는지 궁금합니다. 3. 그 외에 주의할점이 있는지 고견 부탁드리겠습니다. 감사합니다.

centricon, centriprep을 파는 국내회사가 있을까요?

단백질 발현분리 정제 실험을 진행하고 있습니다. 저희가 단백질별로 형질전환이 된 e.coli를 극저온 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하고 있습니다. 미리 많이 배양을 해놓은 상태에서 사용중이라 큰 문제가 없었는데, 지금 양이 조금 부족해지는 것을 발견해서 증식을 시켜서 보관을 해야하는 상황입니다. 배양증식을 할때, harvest 과정 전에 IPTG를 넣고 과발현을 시켜준 상태에서 보관을 하는것인지, IPTG없이 scale-up(main culture)과정만 하여 보관을 하는지, 따로 추가되는 과정이 있는지 궁금합니다 이에 관련하여 다른 lab에서 해보신 분들 조언을 주신다면 감사하겠습니다!

안녕하세요 protein extraction 목적 cell harvest 질문드립니다.   일단 harvest protocol은 이러합니다. (최대한 icing 상태에서 진행) 1. media -> conical tube (dead cell까지 보려고 합니다.)  2. pbs washing 후 -> conical tube 3. 2X trypsin-EDTA 처리 후 incubator 3min 4. media로 cell 모아 -> conical tube -> centrifuge 1500rpm 5min   질문 입니다. 1. trypsin은 아무리 washing을 잘해줘도 잔존하여 단백질을 깬다는 글을 봤는데 이 글과 같이 protein extraction 목적이면 무조건 scraper를 사용해야 하나요? 2. trypsin 처리 후에 media로 cell을 아무리 모아도 완벽히 plate에서 tube로 이동시킬 수 없습니다.. 이 loss가 OD값에 영향을 많이 미치는지 궁금합니다. (최대한 plate에서 tube로 옮길 수 있는 tip 부탁드립니다.) 3. trypsin,FBS 제거를 위해 PBS washing을 두번 하는데 이때 loss가 많이 생길까요?   답변 부탁드립니다.  항상 감사드립니다.  

ChIP과 반대로 DNA로 낚아서 그 부위에 결합하는 단백질을 알아내는 방법이 있나요??

protein extraction을 배웠는데 IGF-1을 treatment하고 extraction을 하였는데 treatment를 하는 이유는 무엇이고 igf-1은 무엇인가요?

제가 제대로 이해한 것이 맞는지 알고 싶습니다.   ki-67은 핵단백질로, '항원'으로써의 역할을 합니다. ki-67 항체가 특이적으로 결합하는 특징이 있어서 ki-67 staining 에 사용됩니다. CFSE는 항체가 아니라 형광염료로써, 세포 내에 있는 단백질에 전부 골고루, 즉 비특이적으로 결합합니다.    각각 항원, 염색물질(유사 항체라고 생각하겠습니다)라는 차이점이 있습니다. 아예 개념이 다르다고 생각합니다!    그러나 둘다 세포 분아 염색법에 관련된 물질입니다.   이렇게 이해한 것이 맞나요?