[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
국립해양생물자원관
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
전체보기 안전점검 LABox
 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
카테고리 전체보기펼치기
질문/투표/프로토콜 등록
Q. WB/ 1,2차 antibody
안녕하세요  WB 1차 2차 안티바디에 대해 아직 정확한 개념이 잡히지 않아서 글을 남기게 되었습니다. WB를 actin으로 단백질을 확인하고자 합니다.   1차 안티바디와 2차 안티바디를 사용하려고 하는데 이렇게 사용을 하면 되는지 확인부탁드립니다.   1차 안티바디는 rabbit 이며, 2차안티바디는 HRP rabbit입니다.   윗선배가 없는 상황이라 너무 기초적인부분을 올려서 죄송합니다. 이전 교수님께서 설명해주시기로는 HRP가 발광을 한다고 하셨던걸로 기억을 합니다. 그래서 2차 안티바디는 HRP가 적혀있는걸 사용해야 dectetion을 했을 때 band가 나온다고 하신걸로 기억합니다.    1차 안티바디     2차 안티바디
회원작성글 AD석사생  |  09.21
Q. Ni-NTA regeneration 이해가 안 가네요..
안녕하세요? 나름 Histag purification 고인물이라고 자처했는데,,, 아주 기초적인 부분에서 질문이 있어 남겨봅니다. 제 질문은 아래와 같습니다.   Elution 후 Ni와 결합한 Imidazole을 어떻게 제거하는가? PBS만으로 왜 제거 되는가?   저는 보통 Elution 후에 아예 Ni를 없애버리고, recharging 하는 방식을 썼었는데, 이게 Elution 후에 그냥 PBS로 washing만 하고 (Ni 유지), 다시 써도 되더라구요;;; 그렇다면 PBS washing이 Ni와 결합한 Imidazole을 고효율로 씻어내렸다는건데… 그게 가능한가요? Imidazole과 competition하는 내 histagged 단백질은, PBS washing에 끄떡없는데 말이죠? 혹시 소중한 지식 있으시면 나눔 부탁드립니다.   *참고) resin capacity는 거의 60 mg 이었고, 그거 다 잡고 PBS washing 후 flowthrough 30 mg정도 또 잡음. 그 외에도 엄청 많이 사용하는데 계속 됨;;
회원작성글 암세포  |  09.21
Q. MS를 이용한 항체 epitope mapping 서비스 제공하는 국내 회사 추전 부탁드립니다.
국내사 중에 HDX-MS 혹은 XL-MS를 통한 epitope mapping 하는 곳들이 있을 까요? 전문적으로 하는 곳 추천 받고 싶습니다.
회원작성글 shkim20  |  09.20
Q. cy5.5 염색
대장균에서 발현/분리/정제한 단백질에 cy5.5 dye를 염색하는 것이 실험실에서 간단히 되는 일인가요?  지식도, 경험도 부족하고, 주변에서 본 것도 없어서 ㅜ.ㅠ 단백질에 염색한 후 마우스에 주입해서, 이 단백질이 어디로 가는지 보는 실험을 하려고 합니다. 일단 염색이 석사생 손에서 수월하게 뚝딱 되는 것인지가 궁금하고요, 또 염색이 잘 되면, 마우스에 들어가서도 하루-이틀 안깨지고(?) 잘 버티는지가 궁금합니다. 이건 케바케일 것 같아 꼭 답 안해주셔도 됩니다!
회원작성글 색연필  |  09.20
Q. transfer 후에 marker는 사라지고 portein은 확인되는 현상 첨부파일
안녕하세요, 대학원 석사 과정 중에 있는 학생입니다. 제목에서처럼 western blot 진행 과정에서 transfer 전에는 marker가 잘 확인 되었고, transfer 후에 gel에는 없지만 membrane에서 marker가 확인되지 않아(정확히는 매우 연하게, 없다싶을 정도로), transfer가 잘 되지 않았다고 판단했습니다. 그래도 혹시 몰라 antibody를 붙여 확인해보았는데, beta-actin 기준 protein 밴드가 뚜렷하게 나타나서... 혹시 transfer 후에 marker는 사라졌으나 protein은 잘 옮겨가는 경우도 있나요? 제가 그 membrane과 똑같은 조건으로 다른 membrane도 동시에 실험 진행 중이었는데, 다른 membrane은 marker가 잘 확인 되었고, protein도 잘 나타났습니다. transfer buffer는 똑같은 것을 사용했기 때문에 문제가 없다고 생각하고, 한 기기에서 두 개의 transfer tank를 연결했기 때문에 기기의 문제라고 보기도 어렵다고 생각합니다. 전압은 100V, 100분으로 설정하였고, gel 농도는 10%입니다. 사진은 beta-actin이고, marker가 확인 된 것과 안 된 것 입니다.(동시에 진행된 membrane입니다.) 혹시 비슷한 경험과 원인, 조언 주시면 감사하겠습니다ㅜㅜ
회원작성글 shinhwa  |  09.20
Q. ELISA 진행할 때 같은 샘플에서도 다른 결과가 나오네요;;
안녕하세요.  저는 최근에 Extracellular vesicle 연구를 시작한 대학원생입니다.  EV의 isolation이후 ELISA로 CD63 단백질 발현을 확인하며 EV의 양을 가늠해 보고 있는데요.  문제는 ELISA 결과를 보면 같은 샘플에 대해서도 어떤 well은 반응이 뜨고 어떤 well은 뜨지 않으면서 편차가 굉장히 크다는 것입니다.  물론 손으로 실험 하다보면 당연히 편차는 생기는 것이겠지만 그 정도가 OD 기준으로 10배 가까이 발생하기도 합니다.  혹시 이런 경우 실험의 숙련도와 상관 없이 고려해봐야 하는 이슈가 뭐가 있는지 경험 많으신 분들께 여쭙니다.  감사합니다. 
회원작성글 대학원생327  |  09.20
Q. HisPur Ni-NTA Purification시 Protein aggregation
안녕하세요, 저는 현재 A라는 eukaryotic protein을 E.coli에서 발현 중에 있습니다. A라는 protein을 insoluble하게 발현하여 activity가 있는 것을 확인했으며, A라는 Eukaryotic protein을 B라는 protein과 한 T7 promoter상에서 연결하여 발현 중에 있는데, 제가 원하는 site에서 보이지 않아 질문을 남겨봅니다. Vector는 pET28a(+)를 사용하여 N,C-ter 양쪽 모두 His-tag이 붙어있습니다. Induction condition은 16~37도 까지 Time 역시 바꿔가면서 Optimization을 모두 진행해보았는데 되질 않는 것 같습니다.  제가 Target으로 하는 예상 kDa는 62kDa인데, Induction후에 whole protein, pellet에는 예상 kDa부근에서 보이는데 Elution시에는 보이지 않고 30kDa부근에서 보입니다. Elution은 imidazole 250mM~300mM로 진행하였습니다. 따라서 protein이 insoluble하거나 His-tag 정제 시 문제가 있는 것 같아 보이는데, 해결이 되질 않습니다. 제가 놓친 부분이 있을까요? 참고로 loading 시 boiling도 하였고, 중간에 종결코돈도 없습니다. 아래 사진 첨부드립니다. 감사합니다.
회원작성글 agaz  |  09.20
Q. SDS page 밴드 번짐? 첨부파일
안녕하세요  SDS-PAGE실험 중 궁금한게 생겨서 질문남깁니다.  이전에는 이런경우가 거의 없었는데 최근에 젤 러닝 후 염색하면 항상 레인 밖으로 번지듯이 내려오는게 보여서요  혹시 원인이 뭔지 아시는 분 있으신가요? 그리고 저렇게 내려온 경우 western blot 과정에서 문제가 생길 수 있나요?
회원작성글 ㅇㅎㅇㅎ  |  09.19
Q. protein induction이란게 뭔지 잘 이해가 안됩니다..
cell에 IL-1b or LPS 처리 후 con에 비해 변화한 western blot band를 두고 선배들이 induction이 잘 된 것 같다고 설명하더라구요. induction과 expression의 차이가 있나요? cell에 IL-1b나 LPS를 처리하면 염증성 사이토카인등이 분비될 것이고.. 그럼 염증 마커들을 확인했을때 마커 두께가 두꺼워 질 것이고..그렇다면 발현이 증가한 것 아닌가요..? induction이라는게 정확히 이러한 실험에서 어떤 상황을 이야기하는 것일까요...?  
회원작성글 gamja  |  09.18
Q. phosphomimetic mutant에 관해서 질문이 있습니다.
안녕하세요, 논문을 읽으면서 공부하고있는 대학생입니다. 다름이 아니라 논문을 읽으며 phosphomimetic mutant, phosphoinhibitory mutant 같은 용어가 많이 쓰이는것을보게 되었습니다. 그런데 논문을 읽으며 보니phosphomimetic 돌연변이가 있으면 인산화가 잘일어나지 않는다고 하는 것을 보게 되었는데요, 실험에서는 이 돌연변이가 이미 인산화되어있는 상태처럼?기능을 하는 것 같아서요ㅠㅠ 대체 이 두가지 돌연변이가 정확히 무엇인지 알 수 있을까요?
회원작성글 lkdjf  |  09.18
Q. 카탈레이스 과산화수소 분해 실험
카탈레이스 과산화수소 분해 실험에서 과산화수소에 감자즙을 거름종이에 뭍혀서 실험하는 것보다 감자를 직접 썰어 넣어서 실험할 때가 떠오르는데 시간이 더 많이 걸리는 이유가 뭔가요? 감자를 직접 썰어서 실험을 하면 생기는 문제점이 감자 두께가 일정하게 썰리지 않아 변인 통제가 제대로 되지 않는다는 점 말고도 또 있나요?
회원작성글 수2대  |  09.17
Q. 단백질 추출 및 정량 실험에서 쓸 단백질 종류 알려주세요
고등학생이구요 단백질 추출 및 정량 실험에서 무슨 단백질을 써야할지, 어떻게 구해야하는지 잘 모르겠습니다... 이왕이면 의약용으로 활용될 수 있는 단백질로 실험하고 싶은데 괜찮은 단백질 추천부탁드립니다!
회원작성글 ㅊ챙  |  09.15
Q. westernblot 트랜스퍼 시 두 멤브레인의 경향성이 다르게 나와요
wet 트랜스퍼 할때 pvdf 카세트가 두개 들어가잖아요? 트랜스퍼 돌릴때 같은 샘플로 1번, 2번 pvdf 카세트에 트랜스퍼 한 후, 2개 멤브레인에 항체 반응을 하면 1번 2번 멤브레인의 밴드가 경향성이 같게 나오지를 않네요. 이런 경험 하신분 계실지, 어떻게 해결하셨는지 아시는분 혹시 있으신가요? 
회원작성글 AGCT  |  09.15
Q. Heat shock
Ip 하고 heatshock 5분 정도 하려고 했는데 15분정도 방치해버렸습니다ㅠ 샘플이 아까워서 wb까지 진행했는데 flag은 나오는데 다른 항체에서는 안보이네여,, 원인을 찾고있는데 heat shock 오래한게 크게 문제가 될까요..?
회원작성글 바닷가  |  09.14
Q. 전기영동 관련 질문드립니다.
안녕하세요.   Cell에서 천연물의 활성을 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 진행하고 있습니다.   실험실의 전기영동 프로토콜대로 실험을 진행하고 있으며 결과는 만족스럽게 얻고 있습니다. 평범하게 실험하던 도중 궁금하던게 떠올라서 질문드립니다.   프로토콜에 따르면 겔을 만들고 샘플을 로딩할때 양쪽 끝에 샘플버퍼(실험실에선 2x laemmli sample buffer 사용함)을 로딩하고, 양쪽 끝에서 두번째에는 마커를 로딩하고 있습니다.   혹시 양쪽 끝에 샘플버퍼를 로딩하는 이유를 질문드려도 괜찮을까요??   감사합니다.   항상 궁금하던 질문이어서 계속 찾아본 결과.. 결국 못찾았습니다.  
회원작성글 생약학  |  09.13
Q. overexpression 이후 WB 결과 제가 원하는 protein의 size가 다르게 나옵니다..
Cell에서 Lipofectamine으로 제가 원하는 protein을 overexpression을 한 후에  (Lipofectamine 2000제품 사용하였고 제조회사 protocol로 진행했습니다.) FLAG antibody, target protein antibody로 IB를 진행했습니다.  바라는결과대로 단백질이 expression되어서 FLAG band도 detection되었고 expression한 단백질도 항체 IB를 통해 control에 비해 많이 detection 되었습니다.   (detection은 2nd antibody와 ECL로 film에서 detection하였습니다) 여기서 문제가 있습니다.  band가 더진하게 나오긴했지만, 제가 원하는 단백질의 size는 100kda인데 더 낮은 70kda부근에서 나왔습니다.    glycosylation정도 생각해봣는데 degly form의 사이즈도 88kda 정도 인것 같아서 아닌거 같습니다.    wb결과가 훨씬더 낮은 kDa에서 발견된 이유는 뭘까요??  (항체문제인가 싶어 다른 실험에 사용했는데 문제 없었습니다.)   아시는분 답변 부탁드립니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 오우  |  09.13
Q. ATP가 없을 때 protein의 phospholylation이 풀릴까요?
안녕하세요, kinase를 넣어 target 단백질의 phospholylation을 진행하려고 합니다.   간단한 기작은 이렇습니다. 두 개의 단백질의 complex를 조성하고 싶은데, 그 중 하나의 단백질에서 phospholyaltion이 일어나면 안정한 complex를 이룹니다. 이 과정에서 kinase와 ATP를 넣어주어 phospholylation을 시켜주는데 후에 complex만을 얻기 위해 kinase를 제거해줍니다.   이때, buffer에서 ATP가 없어지면 complex안의 phospholylation이 풀릴까요? Kinase는 RSK2라는 단백질을 사용합니다. 도움 부탁드립니다ㅠㅠ
회원작성글 코코팜500배  |  09.08
Q. WB 항체를 고르는 중인데 이 조합이 맞을까요?
연구실에 전임자가 없어서 저 혼자 알아보고 있는데 제가 맞게 이해 한 건가 싶어서 질문드려요... 현재 대장균에서 발현/정제 중인 단백질이 10종류가 넘고, 모두 8x His-tagged protein이라 anti-his tag 항체를 사용하여 WB로 확인하고자 합니다. 현재 연구실에 있는게 NBT/BCIP 용액 뿐이고 이거를 쓰려면 AP conjugate를 구매해야 한다 해서 찾아 본 결과가 모 회사의 이 제품들인데 1차항체: 6x-His Tag mouse Monoclonal Antibody IgG2b (His.H8) 2차항체: Rabbit anti-Mouse IgG F(ab')2 AP   제가 이해한 바가 맞다면 1차항체는 mouse에서 나온 IgG 중 type이 IgG2b만을 모은 것이고, 2차항체는 rabbit에서 생산한 모든 mouse IgG에 대한 항체이지만 IgG의 Fc domain은 인식하지 않는다.... 인데 F(ab')2의 정확한 의미를 모르겠습니다. 이대로 구매해서 사용해도 문제는 없을까요?   그리고 확인할 단백질들이 His tag가 N말단에만 있는 것도 있고, C말단에만  있는 것도 있고, 양 말단 모두에 있는 것도 있는데 아무래도 양 말단 모두에 태그가 있으면 WB 밴드가 조금 더 진하게 나타나나요?  
회원작성글 ckk  |  09.08
Q. 단백질 정량(Bradford/BCA assay) 계산이 잘 이해되지 않습니다..
안녕하세요. western blot을 진행하는데 두 분의 선임이 각각 실험하시는 과정을 보고 정리하여 혼자 실험을 하려고 하는데요,  그런데 두 분의 단백질 정량 계산법이 달라 무엇이 맞는지 정확히 알지 못하여 선생님들께 도움을 구하고자 합니다.   먼저 첫번째 선임의 방법입니다. cell pellet lysis 후 Bradford 방법을 이용하여 standard 농도를 0, 1, 2, 4, 8로 지정 후 측정한 결과입니다.  단백질 100ug의 100ul 샘플용액을 제조하고자 할 때 sample number(Conc.) 넣을 protein 양 reducing buffer sample buffer lysis buffer WT(7.9ug/ul) 100/7.9=12.7ul 100/10=10ul 100/4=25ul 100-12.7-10-25=52.3 #11(6.1) 100/6.1=16.4 100/10=10 100/4=25 48.6 실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : NP-40, reducing buffer : Bolt sample reducing agent(10x), sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다. 위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다. 그렇다면 제가 넣은 단백질 양은 30ug이 맞나요?   다음은 두번째 선임의 방법입니다. 제 담당 선임이셔서 계속 이 방법으로 실험을 진행해야 하는데 계산과정이 이해되지 않아서요.. cell pellet lysis 후 BCA assay kit를 이용하여 측정했습니다. sample number Conc.(ug/ml) ratio to 최소양 샘플 4x buffer 필요샘플양 1x buffer 원하는 final wb 샘플 양 #1 1369.500 5.989 26.5ul 13.27ul 66.23ul 106ul #5 228.667 1.000 26.5 79.50 0.00 106 실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : M-PER mammalian protein extraction reagent, sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다. 1x buffer는 4x buffer를 H2O에 희석하여 만들었습니다. 위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다. 위 표대로 만든 샘플은 106ul에 각각 228.667ug의 단백질을 가지고 있는 건가요? 30ul를 로딩했을 때 제가 넣은 단백질 양은 어떻게 되나요? 최저농도로 나온 샘플의 양이 얼마인지 피펫팅으로 대략 파악 후 엑셀에 대입하여 주신 자료입니다. 왜 이렇게 최저농도인 샘플의 양에 맞춰 나머지 샘플 모두 계산을 하는 것인가요? 첫번째 선임의 실험방법보다 이 실험법이 더 정확한건가요? H2O 대신 1x buffer를 넣는 이유는 무엇인가요?   그리고 만들어진 gel을 사용하는데 well 안에 running buffer를 채운 후에 샘플 loading 해도 되나요? 빈 well은 소량의 ladder를 넣은 후 샘플과 동량 맞추기 위해 부족한 양만큼 1x sample buffer를 넣어주나요? transfer 할 때 filter paper와 membrane이 함께 들어있는 novex filter paper sandwich 0.2um pore size를 이용하는데요, methanol에 담갔다가 transfer buffer에 적셔 이용하는 것은 filter paper인가요? membrane인가요? 
회원작성글 notorious..  |  09.07
Q. PARP-1, Caspase3, p53 질문드립니다.
안녕하세요. 현재 암세포에 약물 처리 후 apoptosis보는 중입니다. ​ western중에 궁금증이 생겨 질문드립니다. ​ 1. parp-1(cell signaling 9542s) 를 봤는데 이러한 형태가 나왔습니다. (순서 - 10uM, 5uM, 1uM, control)      total form, cleaved form 둘다 증가하는데 다른 논문들을 보면 cleaved form은 증가하나 total form이 일정하거나 줄어드는 경우가 있더라구요. 어떻게 해석을 해야할지 모르겠습니다.. ​ 2. caspase3(cell signaling 9662s)를 봤을때입니다. (순서 - 10uM, 5uM, 1uM, control)    total form은 줄어드는데 cleaved form이 detect되지 않습니다.  듣기로는 caspase들의 cleaved form은 잘 보이지 않는다는데 팁이 있다면 부탁드립니다.   3. P53이 53사이즈에 나오지 않고 40정도에서 detect됩니다. (cell signaling 2524s) cell은 DLD-1, HCT-116입니다 아직 phospho form은 못봤지만 일반 p53이 하나도 안뜨는건 아닌거같고 40에 뜬 밴드는 그냥 무시해도 좋은 잡밴드일까요?   protocol dead cell까지 harvest 하여 sample을 제작하였습니다. 15%, 10% gel Loading, stacking 50V / separating 100V 250mA 70min transfer (in ice) blocking(5% skim milk/ 1h RT), 1st ab(5% BSA/ 1:1000 4도 O/N), 2nd ab(5% skim milk/ 1:10000 1h RT) 각 과정 사이의 washing은 TBS-T 5min 3회입니다. ​ 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 셀러문  |  09.07
이전  01 2 03 04 05 06 07 08 09 10  다음
실험 회원 등급이란?
실험Q&A 회원등급안내
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고