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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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Q. plasmid vector와 host cell 항생제 질문드립니다.
안녕하세요. 찾아보니 알거 같으면서도 헷갈려서 이런 기본적인 질문을 드리게 되었습니다. 제가 사용하는 벡터는 pet28a이고 kan 저항성을 가지고 있습니다. 그리고 사용하려는 host는 bl21(rosetta)이고 cm 저항성을 가지고 있습니다. 배양시 kan과 cm 둘 다 넣어서 배양을 하라고 하는데 pet28a는 kan 저항성밖에 가지고 있지 않은데 kan, cm 둘 다 넣는 배지에서 배양을 하면 각각은 다 죽는거 아닌가요..? 항생제 하나 넣어서 선별하는건 이해가 되는데 double selection은 이해가 잘 안 되네요 ㅠㅠ 쉬운 질문이지만 답변 부탁드리겠습니다. 항상 감사드립니다.
회원작성글 기적  |  06.21
Q. blue-white screening에서 Multicloning site에 관해 첨부파일
안녕하세요. 고등학교에서 생물을 전혀 안한 생공 학부생입니다. 이번에 한 실험에서, 도무지 이해가 안가는 부분이 있어 질문드립니다.ㅜㅜ  제가 이번에 JM109주의 대장균에 pUC19플라스미드랑, pUC19플라스미드의 MCS에 EGFP발현유전자를 삽입한 플라스미드pEGFP를 넣어 형질전환하여 암피실린배지에 배양하고, PCR이나 SDS-PAGE를 하는 실험을 했습니다. 여기서 제가 궁금한 부분은 blue-white screen에서인데요. 위에서 말한 두 균을 LBA배지, LBAI, LBAX, LBAXI 배지에다가 배양했습니다. (A:암피실린, I:IPTG, X:X-gal) 그랬더니 결과는 pU19는 전부 흰색, pEGFP는 전부 녹색으로 나왔습니다. 저는 이 결과가 맞다고 생각했는데 교수님 말씀으로는 LBAXI 배지에서는 원래 파란색이 나와야 맞다고 하셨고, 저는 여기서 이해가 멈춰버렸습니다..ㅜㅜ αcomplementation 공부할 때, F'lacZ M15에서  ω단편이 발현되고, 여기에 lacZα를 도입해서 발현시키면 두개의 단편이 만나서 베타 갈락토시데이스활성을 회복하고,  여기서 lacZα의 가운데에 MCS부위에 외부 유전자가 들어오면 α단편이 중간에 끊기니까 두 단편이 만나도 활성을 회복하지 못한다고 이해했는데요. 이 실험에서도 MCS에 GFP발현유전자를 삽입했으니까 활성을 회복하지 못하고 흰색이 되어야하는거 아닌가? 생각했습니다. 근데 실험 지도서를 다시 들여다보니, pUC19의 lacZα가운데에 MCS가 있는 반면에 pEGFP에서는 lacZα의 옆에 EGFP가 붙어있더라구요. lacZα가 끊기지 않았으니 파란색으로 나오는 건 알겠지만(근데 그럼 왜 결과는 흰색이 나왔는지도 잘 모르겠네요..), 그렇다면 "pUC19플라스미드의 MCS에 EGFP발현유전자를 삽입"했다는건 대체 어디에 삽입을 했다는건지 이해가 안되었습니다..  lacZα의 옆에 MCS가 있다는 건가요?? 제가 아직 그림을 해석할 줄 몰라서 GFP를 어디에 삽입했고, 왜  lacZα가 말짱한지가 이해가 안되네요ㅜㅜ 혹시 설명해주신다면 정말정말 감사하겠습니다..
회원작성글 화바바  |  06.19
Q. main culture 시간이 지체될때는 어떻게 대처해야될까요?
OD를 측정해서 competent cell을 만들어야 되는데 아직 OD가 적정값에 들어왔는지 확인을 못했는데요. 앞사람의 실험ㅇ나 제가 갑자기 일이 생겨서 doubling time마다 측정을 못할때 우선 4도씨에 넣어놓고 OD값을 측정해본뒤, 아직 도달하지 않았으면 다시 배양기에 넣어놔도 될까요? 4도씨에 들어갔다 다시 배양기로 들어가면 cell한테 충격을 주는거 같아서요. 혹은 RT에 그냥 놓아도 되는건지…?
회원작성글 아직학부생  |  06.17
Q. transformation 후 plate에 colony
transformation 후 colony가 뜬 plate를 3주동안 4도씨에서 보관중 입니다. colony를 pick해서 mini prep하여 안에 있는 vecor 를 cut해서 linear로 만들어 전기영동을 찍어볼수 있을까요? 실험을 배우고 있는데 vector를 cut하고 paste하는 방법을 배우고 싶어서요 너무 오래된거 같아서 진행해도 되나 싶습니다…
회원작성글 아직학부생  |  06.16
Q. 균주가 들어있는 stock
시간이 없어서 streaking 해서 colony를 따서 접종 하는 방법 말고 그냥 균주가 들어있는 stock에서 화염멸균한 이쑤시개나 tip을 담갔다 pick하는 방법 처럼 하여 접종 하는 방법은 안되는 걸까요?
회원작성글 아직학부생  |  06.15
Q. E.coli strain 특징
DH5a, Top10, SURE, XL1 blue 뱔로 특징을 알수있을까요? top10이 XL1 blue보다 cel growth가 빠르다 , vector가 더 작다 와 같은 특징들이요
회원작성글 아직학부생  |  06.13
Q. mini prep 후 vector
yeast 에 들어가는 vector가 얼마 남지 않아 mini prep을 통해 늘려야 된다고 배웠습니다 허나 yeast는 E.coli를 걸쳐서 transformation을 해야된다는걸로 알고있습니다. yeast에 들어가는 vector를 E.coli에 transformation 할수 없는데 어떻게 그 vector를 늘릴수있나요?
회원작성글 아직학부생  |  06.10
Q. mini prep 후 plasmid DNA
안녕하세요 이제 막 배우기 시작한 학부생입니다.   PUC19 plasmid를 가지고 mini prep을 진행하였고 plasmid DNA를 얻는것 까지 진행했습니다. yeast에 transformation을 해야되는데 yeast transformation에 들어가는 vector는 분명 다른것인데 mini prep을 통해 얻은 plasmid DNA는 어떻게 활용하는것인지 질문드려도 될까요?  
회원작성글 아직학부생  |  06.09
Q. plasmid 와 vector가 너무 헷갈립니다
yeast T/F 시에 넣는 vector가 얼마 남지않아서 E.coli com. cell 제작후 mini prep을 통해 얻어내라고 말씀을 해주셨습니다. yeast에 들어가는 vector E.coli에 들어가는 plasmid가 다른것인데 어떻게 vecotr를 늘릴수 있다라는것인지 알수있을까요?
회원작성글 생명학도  |  06.09
Q. plasmid 질문 드립니다
yeast transformation을 할려고 E.coli transformation을 하고있습니다. yeast에 들어가는 vector에 amp 항생제가 들어가는데요 그러면 E.coli에 amp marker가 들어가는 plasmid를 아무거나 넣어도 상관이 없을까요?
회원작성글 생명학도  |  06.09
Q. plasmid가 들어있는 competent cell차이
competent cell을 만들고 transformation할때 plasmid를 넣는걸로 배웠는데요 competent cell을 제작할때 plasmid를 넣을수 있다고 들은거 같아서요 comp.cell 을 제작 후 에 넣는거랑 제작 하면서 넣는거랑의 차이가 있을까요? 또 competent cell 제작시 어느 부분에서 넣는건지…알수 있을까요?
회원작성글 생명학도  |  06.08
Q. competent cell transformation진행 후
E.coli comp.cell 을 T/F 까지 진행 한 뒤 colony까지 다 뜨는걸 확인했는데요 이것이 잘 transformation이 됬는지 알고 싶을때는 다음 무슨 단계를 하면 되는건지 알수 있을까요?
회원작성글 생명학도  |  06.08
Q. plasmid reconstitution
안녕하세요. 제가 며칠전에 origene에서 plasmid를 구매해서 불리려고 하는데 트포가 안돼서 조언을 구하고 싶습니다. plasmid는 lyophilized form이어서 NFW를 100ul 넣고(manual) 10분동안 기다렸다가 사용했어요. 1차 transformation : 50ul(HIT competent cell) + 2ul(plasmid) selection marker : Kanamycin 근데 제가 centrifuge를 안돌리고 했더니 조금 문제가 생겼는지 콜로니가 안자라더라구요. 그래서 plasmid를 -20도에 보관하고 있던걸 꺼내서 다시 녹인 후 nanodrop으로 측정해보니 처음에는 농도가 4ng/ul 나와서 아차싶었습니다. 이때 근데 260/230 값이 40몇인가? 그래서 조금 문제가 되나 싶었습니다. 그래도 다시 녹여보면 되지않을까 싶어서 centrifuge 돌리고 상온에서 10분정도 기다려다가 다시 측정해보니까 500ng/ul까지 올라갔어요. 그리고 260/230 값도 2로 떨어졌구요. 그 상태로 다시 competent cell 100ul(10^8 cell) + 4ul(plasmid)넣고 트포를 진행했는데 오늘도 안나왔네요.. spreading할때는 LB 1ml 넣어서 50ul만 spreading했습니다. 트포는 nonheatshock competent cell로 진행했어요. RBC에서 판매하고 있는 HIT competent cell입니다.ㅠㅠ 고수님들 도와주세요~    
회원작성글 rlaeheod  |  06.02
Q. plasmid 전기영동 실패 원인이 궁금합니다 첨부파일
insert를 vector를 통해서 DH5alpha competent cell에 transformation 한후 X-gal과 IPTG를 도말한 LA배지에 배양해 insert까지 제대로 삽입된 white colony와 vector만 삽입된 blue colony를 얻었습니다. 그 후 white와 blue 에서 plasmid를 추출해내 제한효소 처리를 했습니다. 전기영동은 왼쪽부터 insert, white, blue로 원래대로라면 white에서 insert 한줄 vector한 줄 해서 총 2줄이 보여야 하는데 vector보다 조금 더 간 한 줄만 보이네요. 덜 갔으면 제한효소 처리에 문제가 있어 더 무거웠나? 생각할텐데 더 가게 나와서 실패 원인이 궁금합니다. 실험에 사용한 insert는 vector보다 가벼운 걸로 했습니다. 감사합니다.
회원작성글 파란바탕  |  06.01
Q. transformation 후AMP 배지에 배양할 때 Ampicillin종류 어떤거 사용하나요?
안녕하세요 transformation 후 ampicillin LB Agar배지에 키워야하는 과정에서 궁금한게 있어서 이렇게 질문은 남깁니다.  현재 실험실 시약장에 ampicillin in sodium 과 ampicillin sodium salt가 있는데 이 두개의 시약이 큰 차이가 있는지 궁금합니다. 현재 ampicillin in sodium을 가지고 배지를 만들고자 하는데 혹시,, 잘못된걸까요,,ㅠ?
회원작성글 해조칼슘풍덩  |  05.31
Q. ampicilin 배지 만들 때 Agar 농도 어떻게 하시나요?
안녕하세요 이번에 transformation을 한 뒤 ampicilin+x-gal+IPTG배지에 37도/12h~16h 배양을 하였는데 아무것도 자라지 않아 이렇게 글을 올립니다...   저는 ampicilin 배지를 만들 때 일부러 agar의 농도를 1.8%로 하여 고체배지를 만들었는데, 다른 사람들 배지 조성을 보면 모두 1.5%를 하였더라구요,, 혹시 1.8%로 할 경우 competent cell이 잘 안자라는지... 여쭤보고자 이렇게 질문을 남깁니다.   1.8%로 한 이유는 고체배지에 도말할 때 배지가 찢어지지 않게 하고자 농도를 높였습니다.  
회원작성글 해조칼슘풍덩  |  05.30
Q. OD 값 희석 비율을 잘 모르겠습니다...
안녕하세요 아직 학부생 인턴이라 OD 값에 대한 희석 비율을 잘 모르겠어 질문 드립니다.   OD600 값이 1.37 정도 나왔는데 OD600 값을 0.8로 만들어야 되서요 이럴땐 얼만큼 희석을 해야되는지... 알수있을까요?
회원작성글 생명학도  |  05.25
Q. competent cell 제작 과정 DDW, glycerol 역할
competent cell 제작시 들어가는 DDW, glycerol 은 cell의 삼투압 조절 역할 과 부동액 역할을 위해 들어가는게 맞을까요?
회원작성글 생명학도  |  05.25
Q. 바이러스 recombination 과정 질문
바이러스를 매개로 하여 특정 dna 를 전달하게 하기 위해 bj5183 내 viral shuttle vector 에 linearized dna 를 transformation 시킨 후 제한효소로 recombination 됨을 확인한후 해당 dna 를 dh5alpha에 다시 넣어 dna 를 확보하고 있습니다 이전에도 비슷한 질문을 드린거 같은데 이번에는 확실히 recombination 된 colony 임을 확인하고 transformation 했음에도 recombination 되기전의 band 가 확인되네요. Dh5alpha 에 tf 된 colony 의 dna 는 12개 정도 확인해봤는데 모두다 결과는 같습니다 왜 이런현상이 일어나는지 궁금하고 바이러스 셔틀 백터로 바이러스를 추출해보신 분들의 의견을 묻습니다
회원작성글 오미자랩  |  05.23
Q. trouble shooting 관련 질문드립니다!
comp.cell 제작 후 transformation 까지 진행하여 spreading을 한 후 overnight 후 colony 가 뜨기까지를 기다렸는데 배지에 뜨는게 없더라고요. OD가 0.5였던 e.coli로 시작했지만 1개라도 뜰줄 알았는데 trouble shooting을 진행시 어떻게 해야될까 라는 질문을 받게 되었습니다. 이럴때 어디서 부터 수정을 해야되는게 맞는건지 알수 있을까요?
회원작성글 생명학도  |  05.23
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