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오늘 2
Q
액체배지에 바로 대장균을 키우지 않고 고체배지에 키워서 액체배지로 옮기는 이유가 궁금합니다
24.04.17
안녕하세요. WT, KO group간의 GOI 발현량을 t-test로 p-value를 확인하고자 합니다. 그런데 ddCt로 진행할 경우, 아래 예시처럼 WT의 한 GOI에 대한 발현량 통계분석을 할 때 WT의 ddCt값이 무조건 1이 되어버리니 편차가 0이 되어 one-sample t-test가 되버린다고 하더군요.. WT ㅡ KO (n=3) 1 ㅡX1 1 ㅡ X2 1 ㅡ X3 그렇다면 dCt값이나 2^-dCt를 이용해 unpaired t-test를 돌려 p-value를 보는게 맞을지 여쭙습니다. 생각보다 group 2개를 통게 처리하여 비교하는 논문들이 없어서 여쭙게 되었습니다..
안녕하세요 염증성 사이토카인 분석을 위해서 ELISA kit를 처음 하게 되었습니다. RAW 264.7 cell로 실험을 진행 하려고 하며 24 well plate에 5x10의 4승 cell/well 정도로 하려고 합니다. LPS처리는 1ug/ml 또는 100ng/ml로 생각했는데 논문에서는 1ug/ml농도로 24시간으로 자주 사용하는 것 같아 그렇게 시도해보려고합니다. 궁금한 점은 1. 샘플 1-2시간 전처리 후 LPS 24시간처리 / 샘플과 LPS 동시에 24시간 처리 둘중에 어느 방법으로 샘플의 항염증을 잘 확인할 수 있을지 궁금합니다. - 또한 샘플 1-2시간 전처리 후 LPS 처리 24시간처리의 해당실험에서는 전처리배지를 제거 후 washing 한 뒤 LPS처리가 맞을까요?? 2. 원래 실험하던 셀 농도는 24well에 3x10의 4승 cell/well정도인데 다른 논문에서는 1x10의5승이나 그 이상인것도 많은 것 같습니다.. 셀수가 너무 적다고 할 수 있을까요?
24.04.16
안녕하세요 micro RNA targeting을 연구하고 있습니다 이번에 결과가 잘 나와 qPCR을 찍기 위해 실험을 위해 사용한 식물의 rna를 뽑고 cDNA까지 잘 합성하여 qPCR을 찍었습니다 하지만 결과가 실험군과 control이 반대로 나왔길래 실험군과 대조군 서로 결과값을 바꾸어 2^값을 계산해보니 제가 원하는 값과 그래프가 나오더라구요 이상한것 같아 남은 rna로 다시 cDNA합성하고 qpcr을 찍어보아도 위와 동일했습니다 아마 rna상층액을 옮길때 labeling을 잘못하여 각각 다른 튜브에 넣은것 같습니다 제가 정말 몇달동안 이것만을 위해 실험하다가 이제야 잘 되어서 qPCR을 찍었는데 이렇게 되니 상실감이 너무 큽니다 몇달동안 노력한 만큼 RNA를 뽑거나 cDNA를 합성할때 labeling을 잘 했다고 생각했는데 말이죠.. 내일까지 결과를 다른곳에 송부해야해서 이제 더 실험 못하는데 그냥 정말 어이없는 제 실수로 인해 나온거라 탓도 못하고 힘들네요
S. aureus 에 있는 PBP4 protein을 overexpression하여 정제하려고 E. coli DH5a에 pET28b(+)에 cloning을 완료하였습니다. 이후 BL21 균주에 vector를 transformation을 하고 난 뒤 이를 이용하여 IPTG (0.5 mM) induction을 진행하였으나 induction이 되지 않는 현상을 확인하였습니다. 혹시나 해서 20도 저온에서 overnight으로 진행도 하였으나 딱히 overexpression이 되지않는거 같더라구요 혹시 위 문제를 해결 할 수 있을까요? PBP4가 periplasmic region에 존재하는 protein이라서 overexpression이 불가하는걸까요? 아래 사진에 cloning 완성된 사진도 첨가하겠습니다.
현재 실험실에서 Cloning을 진행하고 있는 대학생입니다 DH5a에 transformation했을 때 생긴 colony를 colony pcr 해본 결과 band를 관찰하였고, 이를 plasmid prep한 후 전기영동을 내려보았습니다. [DH5a;T.F 후 생긴 single colony → colony pcr (band O) → Plasmid prep → eletrophoresis (3번) 1차 시도는 로딩 시 샘플이 손실되어 band가 희미하게 보이지만 insert가 들어간 샘플이 bp가 살짝 높은 것을 확인했습니다.(insert=1,000bp) [왼: vector 오: vector+insert] 2차 시도 시 single cut(hindⅢ)하였고 digestion 시간도 살짝 오래하긴 했지만 1시간 가량밖에 되지 않는데 double band가 관찰되었습니다. [왼: vector 2개 오: vector+insert] 마지막으로 했을 때는 동일한 조건으로 digestion 20min하였을 때 band는 정상적으로 나왔습니다. [왼: vector 오: vector+insert] 혹시 2차 전기영동 때, 저 double band가 왜 생겼을까요..??
SCFA를 분석하기 위해 ether를 피펫팅하는데, reverse pipetting을 해도, 아니면 여러번 분주하는 과정을 취한 후 하여도 여전히 ether가 일반 증기압 속에서도 잘 증발하다 보니 피펫팅을 할 때 조금씩 방울이 떨어집니다. 이를 완화시킬 수 있는 tip을 알려주실 수 있을까요? 빠른 시간에 최대한 정확하게 분석을 하고 싶은데, 이런 기초적인 것에서 막혀서 답답한 마음에 올리게 되었습니다 이건 속도전 밖에 답이 없는걸까요?
안녕하세요 enzyme reaction 후에 생성된 cyclohexanone을 분리하기위해 diethyl ether, dichloromethane을 사용해봤는데 extraction, evaporation 후에 hplc로 검사해보니 물질이 다 사라져있었습니다. 이유가 뭘 까요? solvent가 문제라면 다른 solvent 추천을 부탁합니다.
동시에 나타날 수 있나요? 나타날 수 없다면 그 이유도 궁금합니다.
안녕하세요. 대장균을 숙주로 재조합 펩타이드를 생산하는 실험을 진행 중이고, 최종 step으로 펩타이드를 C18 Column 으로 분리한 뒤 유기용매에 녹여진 상태에서 동결건조한 뒤 사용하려고 합니다. 그런데 제가 HPLC와 C18 column을 다뤄보질 못하여 질문드립니다. 제 펩타이드는 고농도 NaCl(500mM)의 용매에 녹아져 있는데 이 상태로 C18 컬럼에 주입할 시 컬럼에 문제가 생길 수 있을까요? NaCl 이 C18 column에 안 좋은 영향을 끼칠 수 있나요?