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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. 웨스턴 블랏용 단백질 추출
보통 60파이에 seeding 한 cell에 drug를 24시간 treat하고 난 뒤, western blot sample을 준비합니다.  1.죽은 cell까지 harvest하기 위해, media를 suction하지 않고 media는 걷어서 1.5 ml tube에 모은뒤에 2.10000 rpm에서 30 sec - 1 min 동안 centrifuge를 하여 pellet이 만들어 지도록 합니다.   3.media를 suction한 후, cell pellet을 ice에 박아둔 뒤  4.부착되어 있는 cell을 한번 피비에스로 워싱한후 lysis buffer을 넣어서 lysis 되도록 놔둔 후, 스크래퍼로 cell을 긁고나서 3번 cell pellet에 함께 넣어 cell이 잘 lysis 되도록 피펫팅을 여러번 합니다.  5. 4도씨 냉장고에 10분간 넣어두거나 ice에 박아둔 상태로 30분간 놔둡니다. 6.12000 rpm에서 10분 또는 15분 동안 centrifuge를 한 후 pellet이 생기면 상층액만 따서 추후에 BSA로 정량을 합니다 이때 피비에스로 워싱하는 과정을 생략해도 될까요? 
회원작성글 카스테랑  |  09.02
Q. 마우스 근육 조직 단백질 beta-tubulin
skeletal muscle cell을 lysis해서 웨스턴 할 때는 beta-actin을 주로 보던데 왜 skeletal muscle tissue를 lysis해서 웨스턴 할 때에는 beta-tubulin을 주로 보나요? 그리고 kidney lung liver tissue protein을 같이 볼때도 beta-tubulin을 붙여도 될까요?
회원작성글 별헤는밥  |  09.02
Q. NAGase 1차 항체를 구매하려는데... 이런 case는 선생님들은 어떻게 해서 결정하시는지 궁금합니다.
안녕하세요.   오늘도 웨스턴으로 고통받고 있다 질문 올려봅니다 ㅠㅠ   1차 항체를 주문하려는데, 같은 회사 같은 name 인 경우가 있더군요   Polyclonal Antibody to N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase (NAGase) MBS2007249 from MyBioSource.com | Biocompare.com   Polyclonal Antibody to N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase (NAGase) MBS2004706 from MyBioSource.com | Biocompare.com   N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase (NAGase) 1차 항체를 알아보고 있는데,   1) 위 항체는 위 회사 외엔 찾질 못함 2) 두 링크 다른 정보는 cat#, protein sequence - protein sequence로 blast해보니... 구분을 위한 결과가 나오진 않음 3) 둘 다 citation된 논문이 없음   이런 경우는 항체 choice를 어떻게 해야 할까요??   고수 선생님들의 조언 부탁드립니다 ㅠㅡㅠ   감사합니다.      
회원작성글 kodo2001  |  09.02
Q. stripping
처음 membrane을 찍고 band가 잘 나오길래 stirpping해서 다른 antibody 결과도 얻으려고 진행 했는데요, 처음 잘 나왔던 밴드가 stripping 진행 후 안나올 수도 있나요? 처음 붙인 항체와 stripping 후 붙인 항체가 다르긴 한데, 이런 경우 두번째 antibody가 잘 결합을 못했다고 해야 하나요?    원래 stripping 후에 잘 붙었었는데 갑자기 이러니깐 난감하네요,, 아니면 제대로 stripping이 이루어지지 않아서 안 붙을수도 있나요? sample이 없어서 stripping을 해야 하는 상황입니다 ㅜㅜ
회원작성글 쿵쿠따리쿵쿠따  |  09.01
Q. 골격근 웨스턴 house keeping gene
mouse skeletal muscle protein을 웨스턴할 때 house keeping gene으로 beta-tubulin을 보는 이유가 무엇인가요? beta-actin을 보면 안되나요?
회원작성글 별헤는밥  |  08.31
Q. 웨스턴 로딩시 오래했을 때
웨스턴 로딩할 때 오래 로딩하면 어떻게 되나요? 마커가 아래로 빠지게 되는 경우 위에 남아있는 마커 영역의 단백질은 남아있는 건가요?
회원작성글 별헤는밥  |  08.30
Q. western blot 실험 중인데 size marker 발현이 이상해요... 첨부파일
안녕하세요! western blot size marker 궁금한 점이 있습니다!! 현재 SH-SY5Y cell로 p-mtor, mtor western blot 진행 중입니다. (조건은 6% gel, 80V로 천천히 Loading, transfer 진행 시 차갑게 세팅하여 진행하였습니다.)   다름이 아니라 결과 확인하면 size marker가 두껍고 진하게 뭉쳐있게 나옵니다..  size marker는 오염이 되지 않고 다른 western할 때는 예쁘게 잘 나옵니다. 이런 경험 있으신 분들 계실까요,,?ㅠㅠ 방법을 알고 계시는 고수분들 도움 주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 ㄹㄹ  |  08.30
Q. 항체 선택 관련해서 고수 선생님들 조언 부탁드립니다. 첨부파일
안녕하세요.   오늘도 선배 없이 혼자 도전 속에 살고 있는 대학원생입니다.   우선 제가 찾고 있는 항체는 mouse androgen receptor라는 항체입니다.   https://www.biossusa.com/products/bs-0118r   이 주소를 봐주시면 감사하겠습니다.   제가 궁금한 부분은 androgen receptor라는 단백질은 제가 알기론 약 100 kda 이상인 것으로 알고 있는데, 위 링크의 androgen receptor 항체의 경우 약 48 kda 쯤에 밴드가 나타나는 것을 볼 수 있습니다.   그렇다면, 제가 알고 있는, 그리고 가장 많이 인식 되는 100 kda 이상이 이 단백질의 진짜 kda인지, 아니면 저 위의 링크 항체처럼 48 kda에 밴드가 떠도 신뢰할 수 있는 androgen receptor 1차 항체인지...  궁금합니다.   가끔 항체 서칭하다보면 이런 경우가 종종 있는데... 고수 분들께서는 어떻게 항체를 찾으시는지 저런 정보를 접했을 때, 어떻게 바라보시는지 관점이 궁금합니다.   깊은 조언 부탁드립니다.    읽어봐주셔서 감사합니다.  
회원작성글 kodo2001  |  08.29
Q. westen blot background가 검정색 첨부파일
두 well에 target protein antibody를 처리하고 본 사진입니다 actin으로 했을 때는 배경이 흰색에 band가 검정색으로 나왔는데 여기서는 배경이 훨씬 어둡고 검은색 띠 같은 게 살짝 보이긴 하는데 저 부분이 target protein이 맞나요..? background가 왜 어둡게 나오는지도 궁금해요 ㅜㅜ
회원작성글 징이삼  |  08.28
Q. 단백질 western blot 도와주세요 ㅜㅜ 첨부파일
두 개의 well에 loading한 건데 actin 결과가 이렇게 겹쳐서 나온 거는 뭐가 잘못된 걸까요..ㅜㅜ 그리고 target protein 2개는 아예 band가 안 나왔어요..ㅠ   actin은 저렇게 선명하고 나오고 다른 단백질은 안 나왔다는 건 뭐가 문제가 있었던 걸까요..ㅠㅠ
회원작성글 징이삼  |  08.28
Q. non-reducing condition으로 웨스턴 진행 시 loading control의 condition은 어떻게 해요?
안녕하세요 hepatic stellate cell로 fibrosis 관련 시험을 진행 중입니다.   Col1a1을 확인하고 있는데 non-reducing condition으로 진행하여 mercaptoethanol 없는 샘플 버퍼로 heating 없이 loading 하고 있습니다.   근데 지금까지 loading control은 beta-actin, GAPDH, alpha-tubulin 다 reducing condition으로 확인하여 왔는데 Col1a1과 같은 gel에서 확인하기 위해 non-reducing condition으로 같이 확인하여야 하나요? 그래도 잘 잡히나요?   꼭 Col1a1을 확인할때만 non-reducing condition의 loading control이 흔들려서 고민입니다...
회원작성글 밤퇼  |  08.23
Q. phospho Serine/threonine antibody
안녕하세요. phospho-serine/threonine antibody중에 잘 되는 antibody 추천좀 부탁드립니다.   
회원작성글 김지미  |  08.22
Q. zo-1 band 추정 문제.. 도와주십시오 ㅠ
제가 ZO-1을 8% SDS page gel에 mouse colon lysate유래 단백질을 10ug per well로 로딩하여 전기영동후, transfer하여 촬영하였습니다. 두번째 사진의 252 kda 위치의 밴드, 첫번째 사진의 젤 위 밴드를 기준으로 평 가하면 정말 만족스러운 결과가 나오는데 항체의 data sheet에 따르면 220 kda라 위에서 두번째의 흐릿한 결과가 되게 됩니다. 1) 타 논문들을 확인한 결과 간간히 250kda에 위치한 band를 사용해 result에 실은것을 확인할 수 있었으나 위 항체가 아니기 때문에 근거 는 될 수 가 없겠죠?   2) 혹시 높은 kda의 단백질은 정확한 위치에 안 나올 수도 있을까요?
회원작성글 caco2  |  08.22
Q. Ip 웨스턴,,
안녕하세요. 지금 IP 하고 웨스턴하는데 결과가 나오지 않아 한달째 고생중입니다ㅠ Input과 ip같이 넣고 dgkd를 1차항체로 2차는 안티rabbit쓰는데 ip만 나오지 않네요,, Ip실험이 문제인가 하여 anti flag 항체로 실험을 했을땐 정확하게 밴드가 보여 시료에는 문제가 없다고 판단했습니다. 또 input은 잘 나오니까 sds나 transfer의 문제도 아닌것 같고,, 실온에서 1차 항체 반응시간 3시간, 2차항체 1시간 후 1시간 워싱하는데 1차항체를 on해볼까요? 아니면 1차항체 1:2000, 2차항체 1:10,000하고 있는데 비율을 좀 타이트하게해서 농도를 진하게 해보는게 좋을까요 내일 꼭 데이터 얻고싶습니닷ㅠㅠ
회원작성글 바닷가  |  08.21
Q. 면역침전 stst3 dimer 형성
안녕하세요. 석사 3학기차 IP 실험 중입니다. 실험진행 중 궁금한 점이 여러 개 생겨 여쭤봅니다!  1. 약물처리 시 stat3의 dimer 형성 억제 확인 실험을 진행하려고 하는데 WB 시 젤(gel)에 SDS가 포함되지 않는 것이 좋은건가요...? 2. NON-REDUCING SAMPLE BUFFER은 phospho form 확인 시 진행하면 좋다고 들었는데 제가 보는 Marker는 total STAT3입니다. (CELLSIGNALING #9139) 저의 경우에는 Loading dye에 2-mercaptoethanol 제외하고 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue and 0.125 M Tris HCl(pH 6.8) 이 조성으로 만들었습니다.  3. 또한 Input에 대한 개념을 아직 이해못했습니다.. input은 ip가 되지 않은 sample(lysate)을 같이 wb으로 넣어주는건가요...? 아님 dimer 실험에는 input이 필요없는건가요? ip관련해서 작은 팁이 있으시다면 부탁드리겠습니다!  감사합니다.  1. SK-hep1 cells were plated in a 90 mm dish (4.09x105 cell/well) and treated with drug  2. The cells were washed with ice-cold PBS and lysed in 1× lysis buffer for 1 h on ice followed by centrifugation at 13,000 rpm for 15 min. 3. The protein concentration was determined by using the Bradford protein assay. 4. Cell lysates (200 μg) were subjected to immunoprecipitation by shaking the primary STAT3 antibody and protein A/G agarose bead(sc-2003) suspension at 4 °C for overnight. ➜ 1° antibody 1:100 ➜ agarose beads: 50 uL, total volume (lysates+beads+ddw) 450 uL (ddw로 total volume 맞추는지?) 5. After centrifugation at 2,500 rpm for 5 min 6. Immunoprecipitation beads were collected by pouring the supernatant and washed with cell lysis buffer. (500μL) and centrifugation at 2,500 rpm for 5 min. ➜ Repeat 3 times 7. The immunoprecipitation beads were then mixed with 20 μl of 2× SDS Loading sample buffer and boiled for 5 min at 95 °C and centrifugation at 5,000 rpm for 1min. 8. Supernatant (20 μl) from each sample was collected by centrifugation and loaded on SDS-polyacrylamide gel.  
회원작성글 달봉달봉  |  08.19
Q. 그날 만든 western blot sample을 가지고 다른 젤에 내렸는데, 경향이 달라요..ㅠ
안녕하세요.    웨스턴 블럿을 하고 있는데,   당일 만든 샘플을 가지고 당일에 내리는데,   왜 젤 마다 경향이 다를까요...   이게 그 말로만 듣던 똥손인가요...ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ   미쳐버리겠습니다..
회원작성글 오호로오오호  |  08.19
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