안녕하세요. 요새 T cell line을 가지고 실험중입니다. CRISPR/cas9으로 특정 유전자를 KO한 후 ELISA로 해당 유전자가 조절하는 단백질을 정량하고자 했는데 오히려 더 많이 나오더라고요. 제가 보유하고 있는 sgRNA와 cas9는 HEK293T에서 90%이상의 indel이 발생함을 확인했습니다. 물론 T cell에서 도입 효율이 떨어지겠지만 단백질양이 증가하는 것이 이해가 안됩니다. 혹시 이런 경우도 있나요?  그게 아니라면 prep 문제려나요 ㅠ 도움부탁드립니다.

  안녕하세요. 비전공자입니다. pcr 진행 후 전기영동을 진행하는데 로딩다이 끌림이 발생해서 바꿀려고 합니다. 혹시 브랜드마다 차이가 있을까요?   현재 바이오팩트 100bp 로딩다이를 이용하고 있습니다. 

안녕하세요, TKO 만들다가 너무 애먹고 있어서 도움을 요청하려고 합니다. 첫번째 KO을 stable하게 만들때 blasticidin selection을 이용하였고, 두번째에 CRISPR gRNA-Cas9-Puro 발현을 이용하여 퓨로마이신 selection 이용하여 selection 하고 세번째로 gRNA-GFP 발현을 이용하여 sorting 하려고 했는데 GFP sorting 에 어려움을 겪고 있습니다.   혹시 클로닝을 이용할수 있거나 완제품으로 판매중인 plasmid중 blasticidin 과 Puro 와 겹치지 않는 selection 방법이 있을지요..   항생제 selection이 아무래도 가장 빠를것 같아서 겹치지 않는 항생제를 찾고 싶은데 일반적으로 TKO를 어떤 방법으로 만드는지 궁금하여 여쭤봅니다.   부디 도움 주시면 감사하겠습니다!

항생제를 dDNA에 넣어서 design하여 integration하여 지켜보자 라는 말씀을 박사님들께서 하시는데 무슨 뜻인지 이해가 안가서요…

    DNA double cutting 하여, 전기영동을 해서,  100bp 작은 사이즈를 볼려고, 50V_ 40분 3% agrose gel로 내렸는데,,  100bp 부분에 시커멓게 나와서 ㅠ  2%로 해도 똑같이 나오더라고요 ㅠ 100bp  부분에 시커멓게 안나올 수 있는 방법이 있나요? ㅠ

IBS에서 개발했다는 신델라 기사에서 신델라 기술은 모든 암 형성 과정에서 공통으로 생성되는 InDel 돌연변이의 DNA 이중나선을 잘라 DNA 손상복구를 막음으로써 암세포를 죽인다. 는 부분이 있습니다. 모든 암 형성 과정에서 공통으로 생성되는 InDel은 어떤 게 있나요?(기능/특징)

90도 이상의 고온에서는 DNA가 변성될 수 있어서 90도 이하의 온도에서 PCR을 진행하여야되나요? 내열성 효소가 있기 때문에 고온에도 변성되지 않고 버티는걸로 알고 있는데.. denaturation 단계에서도 94도 온도에서 진행하는데 이때도 DNA가 변성될 위험이 있는건가요?

total volume 20ul Final conc. 1.0ug 일때 DNA(1ug/ul)의 volume의 값은 어떻게 구하나요? 10X Reaction Buffer의 경우 Final conc. 1X로 volume 값은 2로 구했는데 이 방법처럼 구하면 되는건가요? 이 방식대로 계산하면 volume이 20ul 나오는데 맞나요? 그리고 10X Buffer에서 volume이 2가 나왔는데 이것만으로 Final conc. 알 수 있나요??

total volume 100µl final concentration이 1µg/µl 이 조건에서 sample 값과 DW를 구해야되는데 sample 1 농도(µg/µl) 14 일때 sample 7.1µl DW 92.9µl 이렇게 구했는데 final concentration이 10µg/µl 경우 sample과 DW 구하는 방식이 달라지나요?

 gene editing으로 donor vector의 gene을 KI하는 실험을 하고 있습니다. 여태까지는 ZFN vetor (R/L), ZFN donor vector에 원하는 gene을 nuclofection으로 잘 넣어왔습니다. addgene에서 받은 vector이고, HA는 각 800 bp가 조금 넘습니다.  최근에는 ZFN 대신 Crispr/Cas system으로 KI을 전환하려고 합니다. 여태 써왔던 동일한 target에 ZFN R/L 대신 gRNA+Cas9을 RNP로 넣고, donor vector를 그대로 쓰려고 합니다. 그런데 ZFN 때는 딱 cleavage 양 옆으로 HA이 맞아 떨어졌는데, CRISPR cut site는 11bp 정도 떨어져있더라구요. 이 경우에도 제대로 KI이 될지? 경험자분의 의견을 여쭈어봅니다. 그리고 off-target이 적은 target sequence가 하나 더 있는데, 이 경우에는 아예 170 bp 정도 떨어져있습니다. 이 쯤되면 그냥 HA을 새로 design하는게 나을까요? 사실 저희 연구실과 제가하는 일은 gene editing과는 관계없는 곳이라, 가능하면 addgene에서 받은거에 최소한의 일만 하고 싶어서요.    미리 답변에 감사드립니다.   

CRISPR Cas9을  sgRNA plasmid Cas9 plasmid dornor oligo 이렇게 실험 중인데 haplotype이 나오면 sanger에서  two peak이 떴다가 single peak이 떴다가 하나요? 두 번을 읽었는데 한번은 에디팅 전 후의 double peak이 뜨고 한 번은 에디팅 전의 원래 peak이 뜹니다.   어떤 것을 믿어야할까요?

virus의 double strand DNA 유전체는 1.0x105 kD 분자량을 지닌다. 뉴클레오타이드 AMP GMP TMP CMP의 각 분자량은? 4개의 평균값은?

DNA extraction 시 PCI용액을 넣어주는데 PCI용액이 든 병에 상층액과 하층액으로 나누어져 있더라구요 여기에서 상층액은 넣지 말고 하층액만 넣어서 실험을 했는데 상층액은 왜 있는 것이고 무슨 성분의 시약인가요?

안녕하세요 DNA추출실험을 할때 마지막 과정에 DNA pellet을 0.1x SSC solution에 녹이고 나노드랍을 찍어 purity를 확인했는데 SSC solution에 왜 녹였는지, 이 용액의 역할은 무엇인지 알려주실 수 있을까요?

연구실에서  PDO 봉합사에 식물추출 PDRN 코팅을 하여 전임상 동물실험을 공인기관에 의뢰를 하고 싶은데 봉합사 시술에 관한 프로토콜을 가지고 있는 곳이 없더라구요 혹시나 아시는 곳 있으면 많은 답변 부탁드립니다. 시험은  이미지 분석(주름), (면적) In vivo(콜라겐 증가율) (염증인자 감소율)   정도 확인하려고 합니다

과제 연구를 기획중입니다.  과제 연구의 주제를 세포를 삼고 돌연변이를 관찰하는 실험을 하고 싶은데, 여기서 너무 손이 많이 가는 플라스미드를 제거해서 관찰 하고 싶습니다.  세포가 살아있어야 하는데, 검색 해보니 플라스미드 추출 밖에  없어서 플라스미드를 제거한 살아있는 세포 만드는 법을 알려주세요 :(