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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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Q. 안녕하세요, Real time PCR의 Dissociation curve에 대한 질문을 드리고 싶습니다.
안녕하세요, 현재 target gene의 mRNA를 cDNA로 합성시킨 뒤, Real time PCR로 housekeeping gene과의 상대정량을 분석하고 있는 대학원생입니다.우선 바쁘신 와중에 이 질문을 보러 와주셔서 감사합니다.다름이 아니오라 평소와 다름없이 sample 분석을 하고 있던 도중에 error가 발생하여서 원인을 찾아보다가 유사한 사례가 안 보여 여기에 질문을 올리게 되었습니다.첨부한 캡쳐본을 보시면 Amplication curve 자체는 꽤 괜찮게 나온 것 같은데 최종 부분이 약간 불안정 형태를 띄고 있습니다.이것이 좀 의문스러워서 Dissociation curve를 확인해봤는데, one peak가 형성되긴 했지만 그 전에 아래쪽으로 또다른 peak가 형성되어 있는 것을 확인했습니다.Real time PCR에 돌린 primer가 다른 product를 형성하면 위쪽으로 또다른 peak가 생긴다는 것은 숙지하고 있으나, 아래쪽으로 peak가 생긴 것은 처음 봤습니다.사용한 primer가 target gene만 잡는 것은 확실히 확인했고, 그 전까지 다른 sample들의 모든 curve가 깔끔히 나왔었는데 갑자기 이런 현상이 발생되어 매우 당황스럽습니다.아래쪽으로 peak가 생긴 것은 무슨 의미이고, 이 또한 증류수-시약 및 샘플의 이물질이나 오염 때문에 생긴건지 궁금합니다. 그리고 첨부한 캡쳐본의 data는 쓸 수 없는지, 괜찮은지도 알고 싶습니다.이런 현상에 대해 작은 단서라도 주시면 감사드리겠습니다.
괴물  |  2016.05.09
Q. 한천이랑 agar powder랑 다른가요?
미생물 배양하는 실험을 하려고하는데 한천이랑 agar powder 중에 아무거나 써도 똑같은건가요가격차이가 많이 나서요
공학창조  |  2016.05.02
Q. Molt-4 Cell 에서 cytokines 측정?
Molt-4 cell line으로 사이토카인을 RT-PCR해야는데아무리 프라이머를 제작해도...문제점이 없는것같은데 밴드가 보이지 않습니다이제 생가간건데Tcell activation 시키는 것으로 Concanavalin A를 처리하는 경우가 있는데 그것처럼 molt-4 CELL에도 activator를 처리해야 cytokine이 나오는 것일까요?RT-PCR 돌릴건데...아무래도 이제 그게 문제가 되네요...세포를 다른 종류의 세포로 바꿀까하는데 그거보다 activator가 필요하다고하면세포를 바꾸는게 무의미할것같아서요...참고문헌도 있으면 소개해주셨으면 합니다ㅠㅠ
회원작성글 west  |  2016.04.21
Q. pcr primer
reverse transcription pcr하려고 논문을 참고 하려고 하는데 real time pcr primer밖에논문에 나오지 않는데 같이 써도 되는건가요 ㅠ 도움 부탁드립니다 ㅠ
ask  |  2016.04.14
Q. primer 제작할때 cds ??
NCBI에서 mRNA를 검색하여 RT-PCR을 하기위한 Primer를 제작하고있습니다그런데 유전자 서열을 보면 cds가 있는데 실제로 단백질발현이 되는 부위라고 알고있습니다그래서 그부분을 이용해 PRIMER 3 로 primer 디자인하다가안되서 blast를 이용해서 다른 것이 걸리지 않는 것을 골라서 프라이머를 제작하였습니다그런데 안나오는데 혹시 cds부분만 해서 그럴까요? cds 아닌 전체 서열을 넣어서 프라이머를 제작해야되는건가요?
회원작성글 west  |  2016.04.08
Q. real-time PCR 을 이용한 유전자 발현 분석 실험하시는 분들, 도와주세요.
안녕하세요. real-time PCR 을 이용한 유전자 발현 분석 실험을 진행하고 있습니다.현재 lab에 선배가 없는 상황이고,지도 교수님께서도 과제 관련실험과 논문쓰기에 급하셔서비과제 실험인 제실험의 trouble shooting을 해주지 않아 몇개월째 나아가지 못하고 있는상황입니다.전혀 기존의 lab protocol이 없는 상태에서 구글링과 브릭 및 여러 참고 논문들을 통해여기까지 왔지만 한계에 부딪혀 도움을 청해봅니다.제 실험은 virus 감염 cell과 비감염 cell(mock)을 대상으로 시간별로 RNA를 추출하여target gene의 발현을 보고자 하는 실험입니다.사용한 cell은 overnight serum starvation 후 virus 감염후 시간별로 수확하였고RNA추출 후 nanodrop으로 농도를 측정하여 total RNA 100ng 으로 RT를 진행하였습니다.그 후 SYBR을 이용하여 real-time PCR을 통해 결과를 보았습니다.                                           Ct값 예상       1차실험(total RNA 100ng)       2차실험(500ng)target     virus infected cell         낮게            20~25(시간별로 경향성 X)          20~23gene              mock                  높게            20~25(시간별로 경향성 X)          25~30beta      virus infected cell         일정            20~25(시간별로 경향성 X)          20~23actin              mock                  일정            20~25(시간별로 경향성 X)         30 이상예상했던 결과와 현재 상황을 정리해보자면 이렇습니다.저의 예상은 위와 같이 beta actin은 일정한 ct 값을 가지고virus 감염된 세포는 비감염세포에 비해 시간별로 특정 gene의 발현을 높게 보이는 것을 확인하고 싶었습니다.그런데 1차실험결과 엉터리였고ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ....하........RT 시 template RNA 양이 너무 적었다고 판단하여 500ng로 늘려 진행하였습니다.그랬더니 또 제 3의 결과가 나와 더이상 저는 어떻게 해야할지 모르겠습니다.house keeping gene은 늘 일정하다고 배웠는데물론 약간의 차이는 있을 수 있으나 비감염세포는 30이상의 값이 나왔습니다.real time ct값이 30 이상이면 거의 신뢰성이 낮거나 없다고 판단하는 것이라고 들었습니다.제실험의 뭐가 문제일까요?1. virus 감염 실험시 serum starvation 후 진행하는 것이 맞는지 (target gene의 발현이 serum에 영향을 받는다는 reference를 보아 그렇게 진행하였는데같은 gene을 이용한 다수논문에서는 언급되어있지 않은 경우가 많아서 혹시나하고 여쭤봅니다.)2. 1차실험에서보다 2차실험에서 오히려 더 CT 가 높아진 것은 무슨 경우일까요?3. 왜 house keeping gene이 감염세포와 비감염세포에서 차이가 날까요?4. house keeping gene을 바꿔볼까요? (gapdh나 등등)많이 길어졌는데 읽어주셔서 감사합니다. 좋은 저녁되세요.
virology  |  2016.04.07
Q. 안녕하세요, Real time PCR의 Dissociation curve에 대한 질문을 드리겠습니다.
───────────────────────────────────────────안녕하세요, 특정 환경 조건에서의 target gene의 발현량 변화를 관찰하기 위해서 Real time PCR을 실시하고 있는 대학원생입니다.다름이 아니라 Real time PCR을 실시하던 중, 결과값에 의문점이 생겨서 Bric을 포함한 실험 사이트와 구글링, 서적 등을 찾아봤지만 원하는 답을 찾기가 어려워 이렇게 여쭤보려고 합니다.제가 첨부한 Figure 2개는 하나의 target gene을 잡기 위해 후보로 뽑은 여러가지 primer들의 적합성을 보는 것이어서, 동일한 샘플에 각각 다른 primer를 넣고 돌린 Real time PCR의 결과입니다.아래쪽의 Figure는 위쪽의 Figure 중 하나의 그래프를 따온 것입니다. 또한 2개의 그래프 중 위쪽이 Dissociation curve, 아래쪽이 Amplication curve입니다.보시다시피 Amplication curve는 전부 깔끔하게 나왔으나, Dissociation curve의 single peak 부분이 비슷한 지점에서 약간 볼록하게 튀어나왔습니다.Agarose Gel을 통한 전기영동을 했을 때는 모든 primer가 target gene의 bp에 맞게 band 하나만 잘 형성되어서 안심했는데, 막상 Real time PCR을 돌려보니 이대로 진행해도 무방할지 고민이 생겼습니다.따라서 저러한 Dissociation curve 형태 또한 신뢰해도 괜찮을지 경험이 많으신 분들께 여쭤보고 싶습니다.바쁘신 와중에 긴 글 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 괴물  |  2016.04.07
Q. PCR을 하였는데요.. 밴드가 이상하게 발생했어요.. 분석좀 해주세요
맨 왼쪽은 마커, 그다음 밴드들은 원하는 gene 밴드입니다.실험법은 real tme PCR을 하기 위해서 우선 mRNA추출과 밴드 확인을 하기 위해 한 실험입니다.mRNA추출한뒤 cDNA합성을 했고요, PCR pre mix를 이용하여 밴드 확인을 했습니다. 하지만 원하는 bp에 발생된것이 아니고 이런 밴드가 나왔어요..실험 과정중 실수를 하였는데요... cDNA 합성 할때 이용하는  시약은 모든 mRNA를 cDNA로 합성해 주는 멀티시약입니다. 하지만 과정중 제가 모르고 primer를 첨가하였어요.. 그리고 다시 PCR premix 를 이용하면서 또한 primer를 넣었구요, 다음 전기 영동하여 로딩하였는데.. 이렇게 나왔어요.
김양  |  2016.03.25
Q. qPCR 질문이요
RCR 실험중에 궁금한것이 있어 질문올립니다realtime pcr 진행중입니다. 피크가 제대로 잡히지 않아서rt pcr로 겔로도 내려봤습니다겔에 내렸을때는 밴드가 떳습니다..같은 sample로  realtime pcr 기계를 돌리면 피크가 지저분하고 측정치가 제대로 뜨질않습니다혹시 프라이머 문제인듯 싶어 프라이머도 다시 새로 믹스해서 실험을 진행했습니다.b-actin같은경우는 일정한 피크로 수치도 뜨는데보려는 taget 들의 피크가 일정하지않고 들쑥날쑥합니다..측정수치도 뜨는것이 있고 안뜨는것이있고 다 다릅니다...대체 무엇이 문제인지 정말 모르곘습니다..ㅠㅠ 도와주세요 .. ㅠㅠ
민쓰  |  2016.03.22
Q. 논문투고시에 realtime pcr raw data 제출 범위?
제가 처음으로 논문을 쓸려고하는데요. 처음이라서보통 리얼타임 후 데이터 결과가 일반 엑셀이 아니라 기기에따른 확장자 파일로 저장이 되는데논문투고시에 그 확장자 파일을 제출을 하는건가요? 아니면 엑셀파일로 이동된 값만 제출하는건지..아니면 아에 이런 결과가 따로 첨부 필요가 없는건지요?어떻게되는지 처음이라서 여쭈어봅니다.
쿵짝  |  2016.03.14
Q. real time 도와주세요 첨부파일
안녕하세요 realtime PCR 하다가 궁금한게 있어 질문합니다melting cruve 확인하려고 프라이머  b-actin 으로 보았습니다.한가지 프라이머로는 커브를 확인할수없는건가요?master mix 10ulprimer 1ulcDNA 1ul3DW 8ultotal 20ul기계는 abi pcr 기계입니다..이런결과가 나왔습니다...몇일째 하고있는데..문제가 무엇인지 모르겠습니다..혹시 제가 프로그램 작동을 잘못한것일까요..도와주세요 ...
회원작성글 d^^d  |  2016.03.03
Q. RT-PCR, realtime PCR
안녕하세요 PCR 실험중에 궁금한것이 있어 질문올립니다제가 RNA추출까지끝내고 cDNA합성중에  궁금한것이 있습니다.제가 사용하는 cDNA 합성 키트는  Maxime RT RreMix kit 를사용합니다total RNA 0.1~1ug 넣어준후 나머지는 dw로 20ul 맞춰주는데realtime 결과가 나오지않았습니다 혹시 20ul으로 맞춰준 dw의 영향일까요? dw를 사용해도 RNA가 파괴되거나 하지않을까요?cDNA가 합성되지않은것같아서  뭐가 문젠지 너무답답합니다 ㅠㅠ 궁금합니다 ㅠㅠ 도와주세요 ㅠㅠ
회원작성글 kimmi2809  |  2016.02.29
Q. RNA 희석좀 하려고합니다 도와주세요ㅠㅠ
RNA정량이 너무 많이 나와서 250ng/ul정도로 희석하려고 하는데요nanodrop사용해서 1ul따서 했는데466.5ng이 나왔거든요total volume 56ul로 하라고 하셔서 DW 25.99ul에 RNA 30.01ul를 희석했는데 269.2ng로 만족스럽게 나왔습니다.그런데 왜 total volume을 56ul로 잡았는지 모르겠습니다.16개 샘플에서 가장 적은 양이 466.5ng였구요 이걸로 56ul을 잡았는데해석하기가 힘드네요. 알려주시면 감사하겠습니다.ㅎㅎ아 그리고 BSA정량해서 표준곡선 했는데 R^2=0.9991나왔습니다. 잘한건가요?
회원작성글 바이오ㅇㅅㅇ  |  2016.02.02
Q. ucp3 primer가 이상한건가요
mouse에게서 비복근(soleus muscle)을 채취하여 ucp3 primer를 사용해서 pcr을 돌리는데 GAPDH는 결과가 제대로 나오는 반면 ucp3는 증폭이 전혀 안됩니다.논문에서 사용한 primer를 주문해서 사용했는데도 결과가 안나오는데 primer이외의 문제일수도 있을까요?
회원작성글 빨간코광대  |  2016.01.19
Q. 곰팡이에서 RNA를 뽑는 요령이 있나요?
제가 사용했던 키트입니다. easy-RED™ BYF Total RNA Extraction Kit (intron / Cat. 17064)저같은 경우엔 Neurospora crassa를 키우는데, 액체 배지에서 키우다가 다 크면 필터링으로 균사체를 얻어서 짠다음에(?) 그것을 작게 찢어서 딥프리져에서 얼립니다. 그리고 프랩할때 막자사발에서 갈아서 가루로 만들고 그것으로 위 제품의 프로토콜을 진행합니다.95도에서 끓이는 과정은 얼려서 호모게나이즈를 했기 때문에 건너뛰고 했습니다만.... RNA자체가 죄다 깨져서 나오네요... RNA뽑은 후 젤러닝을 했는데 2줄이 보이지 않습니다. 그리고 프로토콜 맨 마지막에 DW로 녹이는 과정에서는 펠렛이 녹지 않아 55도에서 5분간 가열하여 녹였습니다.제가 모르는 요령이 있나요?
회원작성글 절대교주  |  2015.12.29
Q. reverse transcription 조건에 관한 질문입니다.
E.coli에서 total RNA를 추출하여reverse-transcription PCR을 실시하고자 합니다.그런데 RT의 조건이 찾아봐도 잘 나오지 않습니다.알고 계신 논문이나 조건이 있으시면 말씀해주시면 감사하겠습니다.ㅠ혹시 RT조건은 동물세포에서 추출한 mRNA에서 하는 RT조건과박테리아에서 추출한 mRNA에서 하는 RT조건과 동일하게 해도 상관없는건가요?논문을 찾아봐도  PCR에 관한 조건만 나와있고 RT에 대한 조건은 안나와 있어서 질문올립니다.
홍  |  2015.12.28
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