안녕하세요. 대학교 재학중인데요. 혹시 BCA assay 때 test-tube procedure, microplate procedure에 대해서 질문드려요. Test-tube 는 sample to WR ratio = 1 : 20 이고, microplate 는 sample to WR ratio = 1:8 이라고쓰여져있는데, 이 비율은 어느 기준으로 정한건가요?sample양을  10ul 정도 하려고 하면 두 개중 아무거나 해도 상관없는건가요?또, 592nm로만 꼭 흡광도측정해야하나요?

 E.coli lysis buffer에서의 detergent 사용에 대해 궁금합니다. inclusion body로 가는 protein을 얻어내서 refolding 하려고 하는데요,관련 논문을 찾다보니, 해당 논문에서 E.coli 를 lysis 할 때 사용한 buffer 조성은 50 mM Tris pH 8.0, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA 으로, non-ionic, ionic detergent 가 둘다 들어갑니다만, 저희에게 sodium deoxycholate(SDC)가 없어서, sodium dodecyl sulfate(SDS)로 치환해서 사용해도 되는지 여쭙고싶습니다.SDS, SDC 둘다 ionic detergent인데, 제가 찾아본 바로는, SDS가 더 강력하다고 하는데요, 1. 치환해서 사용하는데 문제는 없는지, 있다면 어떤 문제가 있을지,2. 치환이 가능하다면, 그대로 1%를 유지하면서 SDS를 사용해도 되는지, 아니면 농도를 조금 낮춰서 사용하는게 좋을지, 의견 주시면 감사하겠습니다:)

저는 지금까지 tissue나 cell에서 단백질을 뽑을 때,RIPA buffer를 넣고, vortexing을 충분히 해 준 후 (조직은 homogenize), ice에 10-20분 정도 둔 후에centrifuge 해서 상층액만 따서 사용했습니다. western을 문제없이 해 왔는데요.. 핵 내에 위치한 유전자도 무리없이 확인했습니다. 그럼에도 불구하고 sonication 과정이 필수인가 해서요.. 저는 한번도 해본적이 없어서 문의드립니다.

심화기자재 사용에 익숙해지기 위해서 간단하게 콜라겐 추출 및 동정 실험을 진행하고 있습니다.근데 SDS-PAGE polyarcylamide 전기영동은 처음이라 좀 복잡하고 어렵네요. 선생님들께여쭤봐도 잘 모른다고 하셔서 이렇게 bric 회원님들께 부탁합니다.ㅠㅠ 프로토콜은 있어서 실험 중의 간단한 의문들을 여쭤보려고 합니다.1. 모든 선행 논문들을 보면 콜라겐 추출을 할 때 4도 이하의 조건에서 실험을 진행하는데 그 이유가 무엇인지 궁금합니다. 너무 당연한 사실이라 안 나오는 것 같은데 잘 모르겠어서....2. SDS 전기영동 실험할 때 시간이 없어서 2일에 걸쳐 실험을 진행할 예정인데 겔 용액을 미리 만들어놓고 1~2일 정도 냉장보관하다 사용해도 되는지 궁금합니다. 전기영동 하는 그 날에 바로 만들어서 사용해야 하긴하는데 하루에 실험실 사용시간 제한이 있어서 앞의 말한 것처럼 보관하다 사용할꺼같아서요. 괜찮을지 궁금합니다... 여기서 말하는 겔용액은 TEMED는 안 넣고 10% ammonium persulfate만 넣은 용액입니다.3. 사용하고 남은 SDS 용액은 어떻게 폐기하나요? 염기성 용액 폐기통에 버리면 되나요?

 제목 그대로 입니다.단백질 분석 이론 떼는 중인 신입사원인데, 오늘 강의 중에서 어떤 Modification인지는 못들었는데 Alkylation인줄 알고 듣고 있었는데 알킬화는 분자량변화가 57Da정도 되더라고요.아시는 분 계시면 깨우쳐 주십쇼!

ELISA kit을 이용해 VEGF를 검출하는 방법 중형광물질을 사용하는 방법에 관해 현재 VEGF 분석에 주로 사용되고 있는형광물질의 종류와 그에 따른 파장이 궁금합니다.Thermofisher와 같은 ELISA kit 판매사의 카탈로그 상에는 약 5개 정도의 키트가 있고그에 따른 형광의 파장이 모두 다른데 VEGF 검출을 위해선 어떤 형광을 사용하는지 관련논문이나 자료 정보를 알려주시면 감사하겠습니다.

 안녕하세요 박사과정 학생입니다.제가  미세먼지 (fine dust)와 폐의 기능과 관련되어  실험을 계획중인데  동물(쥐)에게 미세먼지를 일으키는 실험 방법이 있나요?? 있다면 주로 어떤 방법을 하시는지 궁금하네요~

안녕하세요.Protein lysate 보관에 대한 질문을 드릴려고 합니다.Protein extraction을 완료하고 sample buffer에 넣어서 열을 가해 denaturation까지 시킨 상태가 가장 안정적이라고 알고 있습니다. 그래서 평소에는 이 단계까지 진행한 후 -80'C에 보관하였다가 western blot을 진행하였고 큰 문제는 없었던 것 같습니다.다음 단계 실험이 시간대별로 protein extraction을 하여 western blot을 해보는 것인데요.Time frame이 조금 촉박합니다. 예를 들면 오후 1시, 오후 3시, 오후 5시 이런 식으로 protein extraction을 해야 합니다.샘플은 mammalian cell line 인데요.이 경우 오후 1시, 3시 샘플은 lysis buffer를 넣고 cells scraping 하여 cell debris와 용액이 함께 있는 상태로 centrifuge tube에 넣어 4'C에 보관하였다가, 5시 샘플까지 얻은 후 다같이 centrifuge를 돌리고, 농도 측정하고, denaturation까지 시킨 후 -80'C에 보관하면 될지요?아니면 오후 1시, 3시 샘플은 어느 단계에서 멈춰서 어떻게 보관해야 가장 좋은가요?또 한가지,centrifuge 속도가 너무 높으면 protein이 degradation 될 수 있다고 해서 6000G에서 돌리는데요. 농도는 괜찮게 나오기는 하는데 돌린 후 supernatant를 보면 debris들이 좀 섞여 있습니다. Supernatant를 딸 때에도 아주 소량이나마 같이 딸려 올라오고요.Cell type마다 속도가 달라질 수 있겠지만 일반적으로 mammalian cell line에서는 어느정도의 속도로 centrifuge 하시는지요?감사합니다. 

단백질의 변성없이 분리하기위해 native PAGE한다음에 gel에서 elution하려는데 잘안되네요... elution buffer로 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1mM EDTA;pH 7.5로 했는데 안되네요.... gel을 잘게 부신다고 했는데 잘 안부셔져서 그런가요???아니면 buffer가 이상한가요???

안녕하세요.브릭에서 많은 도움 받으며 실험실 생활 하고 있는 초보입니다.긴 연휴 잘 보내셨는지 모르겠네요.연휴 기간동안 부족한 실험을 연습하다가 의문점이 생겨서 이렇게 글을 올립니다.부디 질문에 미흡한 점이 있더라도 양해 부탁드립니다.현재 plasmid (overexpression, knockdown) transfection 한 mammalian cell line을maintain (antibiotics selection) 하고 있습니다.어느정도 cell이 증식을 하여서 western blot으로 transfection이 잘 되었는지를 확인해 볼려고 합니다.그런데 저희의 관심 gene에 대해서 검색을 해보니isoform 등의 문제 때문에 western blot 만으로 확인하는 것은 추천하지 않고PCR을 같이 해보라는 글이 있어서 그렇게 진행할 예정입니다.그래서 연휴 기간동안 western blot과 RNA extraction을 다른 cell line에서 연습하던 중에궁금한 점이 생겨서 이렇게 글을 올립니다.그럼 질문 드리겠습니다.1. Trizol로 RNA extraction 하였는데,    trizol에 대한 설명을 읽어보니 RNA를 extraction 하는 와중에 protein isolation 하는 방법도   같이 나와 있었습니다.   방법을 읽어보니 좀 어렵기도 하고 도움을 줄 인력도 전무하고 등등 여러가지 이유로   RNA와 protein을 각각 다른 날 prep 하는 것으로 계획을 잡기는 했는데,   trizol로 RNA를 뽑을 때 protein isolation을 같이 하는 것이   다른 랩에서는 흔히 하는 것인지가 궁금합니다.   이전 bric 글을 읽어보니 추천하지 않는다고 되어 있는 글들도 있어서요.2. RNA extraction 시 주의해야 한다는 글을 많이 읽어서 어제 긴장하면서 연습했는데요.   테이블, 손 등을 알콜로 깨끗하게 하고, 파이펫 팁, ep tube 등을 새로 뜯어서 사용하고   이 정도로 했는데, 혹시 더 주의해야 할 점이 있을까요?    아직 농도, purity 등은 체크하지 못했습니다. 과연 잘 나왔을지 모르겠습니다...3. Plate가 딱 하나밖에 없는데 western blot, PCR을 해보라고 하셔서   한 plate의 cell을 나눠서 써야 합니다 (confluency는 70% 이상 됩니다).   저는 protein prep 할 때는 PBS로 washing -> lysis buffer -> scraper로 cell 채취   RNA prep 할 때는 PBS로 washing -> lysis with trizol -> scraper로 cell 채취   하는 방법을 썼습니다.   그런데 한 plate  (100 mm)안에서 이 작업을 할려면, 제 생각으로는   PBS washing -> trypsin 2 mL -> 37'C 2-3분 incubation -> media 8 mL 정도 추가   -> centrifuge -> supernatant discard    -> PBS를 200 ul 가량 넣고 pellet을 resuspension 하여        100 ul는 protein 용으로 취하여 lysis buffer를 넣어주고        100 ul는 RNA 용으로 취하여 trizol을 넣어주는 것으로 해야 할 것 같은데,   혹시 틀린 부분이나 미흡한 부분이 있으면 코멘트 부탁드립니다.   저는 PBS로 resuspension 하여 100 ul씩 들어가도 되는지가 좀 애매하고   protein을 뽑을 때는 trypsin을 사용하면 안 된다는 bric 글도 있어서    이 부분들이 특히 궁금합니다.4. Stable cell line을 만들기 위해서 geneticin을 처리하고 있는 cell line이 있습니다.   Geneticin은 작용 시간이 느리다고 하고,    논문을 읽어보니 selection 기간을 2-4주로 기술해 놓기도 하였고,   실제 저희 cell도 geneticin을 처리한지 2주쯤 되었지만 아직도 죽어나오는 세포가 있습니다.   프로토콜에는 colony를 형성하기 시작하면    96 well에서부터 selection을 시작해서 expansion 하라고 되어 있던데요.   지금도 colony가 보이기는 하는데, 더 기다리는 것이 맞는지 궁금합니다.   그리고 파이펫 팁으로 colony pick 하는 것은   한번도 본 적도 배운 적도 가르쳐 줄 사람도 없어서   여러 글들을 읽었지만 감이 잘 안 잡히고 조금 걱정이 되는데요.   어떤 팁이라도 주신다면 감사히 받겠습니다.   Cell line에 GFP는 없고 오늘 현미경 하에서 colony가 있는 부분 plate에 점을 찍어봤는데   현미경 하에서는 점이 보이지가 않아서 제가 제대로 된 위치에 점을 찍었는지도   잘 모르겠더라고요 ㅠㅠ5. 브릭 글을 읽으면서 PCR primer를 디자인하고 있는데    이것도 글로만 읽으면서 하려다보니 과연 제가 잘 하고 있는지 불안합니다.   혹시 실질적인 조언이나 팁, 프로그램 추천 등 expert opinion을 주신다면   정말 감사히 받겠습니다.길고 지루한 질문 읽어주셔서 감사합니다.

cell을 trypsin으로 때서 모은 후,  NP-40 buffer (+PI)로 lysis를 하고 bradford를 정량하는데 gel을 150볼트로 내린 후, 5% Skim milk로 상온에서 1시간 블라킹하고 1:5000으로 1차 액틴 4도씨에서 O/N1:5000 2차 rabbit으로 RT에서 1시간으로 분석을 했는데 계속해서 뒤에 흐릿한 밴드가 뜨거나 밑에 밴드가 뜹니다 ㅠㅠ 혹시나 lysis 단계에서 cleaved 된건지 gel을 너무 빨리내려서 그런지 안티바디문제인지 정확하게 어떤 문제인지 몰라 글을 올립니다. 저번 한번은 10번 쯤 쓴 안티바디로 혹시나 안티바디 문제일까 하여 stripping을 해서 새로운 안티바디로 붙히면 다시 이쁘게 뜨는 경우도 있었지만 이번에는 3번 밖에 쓰지 않은 fresh한 상태라 왜 저런 밴드들이 뜨는지 모르겠습니다. 액티 말고 다른  target 단백질들은 one 밴드로 이쁘게 뜨는데 액틴이 저런 경우는 왜그럴까요?

 proteomics, glycomics 관련 공부하고 있는 석사생입니다.실험에서 절대적 정량이 필요한 이유는 무엇인가요?

  

 안녕하세요근육에서 protein을 추출하여 ELISA를 진행하려고 합니다.protein lysis시 RIPA buffer를 쓰려고 하는데직접 만들어 쓰는 경우와이미 만들어진 제품을 쓰는것이 차이가 있을까요?편의성, 가격을 제외한 data를 내는데 차이가 있는지 궁금합니다.그리고 제품을 쓰는 경우 많이쓰는 추천해주실만한 회사를 알려주시면 감사하겠습니다.감사합니다.

지금 알부민이 제거된 serum으로 실험을 하고 싶은데찾아보니 ammonium sulfate를 사용하면 침전시킬 수 있다고 하던데어떻게 해야하는지를 모르겠네요농도를 어떻게 맞춰서 해야할까요???

다음주에 facs를 진행하려고 하는데,원하는 항체가 아직 도착하지않은상태입니다.세포는 키우는기간이 정해져 있어서 extraction을 해놓아야하는데..혹시 cell extraction 하고 몇일동안 둘 수 있는 단계가 있을까요?1차항체 붙이고 fixation 과정에 대기가능하다고 하는데,1차 안티바디가 도착하지않은거라서요 ㅜㅜ...혹시 좋은 대안없을까요??읽어주셔서 감사합니다!

곤충의 미래식량으로서의 유용성에 대해 관심을 가지고 있는 교사입니다.두부나 일반 식품과 비교 하여 곤충이 단백질을 비슷하게 혹은 많이 함유하고 있다는 사실을학생들의 눈으로 확인할 수 있게 실험을 구성하고 싶은데,bradford method로 시약을 구성하면 비교실험이 가능할지 궁금합니다.1. 눈에 보일 정도로 구분이 가능할까요?2. 눈에 보이지 않을 정도의 구분이라면 이걸 수치상으로 비교하기 위한 다른 방법이 있는지 궁금합니다.

collagen zymography를 통해서MMP-1과 MMP-13의 activity를 확인하려 합니다.MMP-1과 MMP-13이 type1 collagenase니깐gel만들때  type1 collagen을 섞어 만들면 될꺼같은데요논문을 찾아보니 casein gel을 사용한 경우도 많더라구요둘 중에 아무거나 써도 무방한가요?혹시 casein을 사용해서 band가 잘 보이는 논문을 알고계시면알려주세요!!! 불쌍한 학생을 위해서 한번만 도와주세요 박사님들!!!!

rat muscle에서 protein을 추출하고자 하는데요!tissue 몇 g에 ripa buffer 몇 ml을 넣어야 하는지 질문 드립니다!