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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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Q. cell lysis 건조한느낌
저와 같은 경험이 있으신 분이 계실까 하여 (검색을 하다 못찾고) 글을 올려봅니다.. thp-1cell을 culture중입니다 cell lysis를 위하여 plate의 media를 제거하고 -20도에 보관해두고 다음날 lysis를 하는편입니다 protease/phosphatase inhibitor+RIPA 를 이용합니다 그런데 어떤날는 lysis buffer가 plate의 세포에 스윽 잘 스며드는 기분으로 약간은 끈적하게 lysis가 잘 되는거 같은데 어떤날은 마치 물의 표면장력처럼 lysis buffer가 plate의 세포위에 동그랗게 맺히기만 하며, 이를 구석구석 억지로 적셔주고 나서 스크래퍼로 긁으면, 마치 창문에 맺힌 얼음을 긁어내듯이 파사삭 세포들이 떨어져 나옵니다.. 이를 억지로 모아 튜브에 옮기면 1분도 안되서 세포덩어리가 그냥 바로 가라앉아 lysis buffer는 위에 떠있고, 덩어리가 아래 가라앉아있는 상태가 됩니다.. 물론 protein 농도도 없구요... 마치 세포가 -20도에서 건조된건가 라는 생각이 드는데.. 혹시 저처럼 plate째로 -20도에 보관해둔뒤 lysis하시는 분들 중에 이런 경우가 있으셨던 분 계신가요?ㅜㅜ deep freezer에 보관하면 좀 나을까요?
회원작성글 레몬티  |  2018.11.10
Q. 항체(단백질) buffer change에 대한 궁금증
안녕하세요.항체가 녹여져 있는 버퍼를 바꿔주고자 합니다.보통은 desalting column을 사용하거나Dialysis 방법을 사용하더군요.그런데 여기서 궁금한 점이그냥 단순히 생각하면 size filtration 하면 될 텐데 왜 위와 같은 방법을 사용하는지 입니다.예를 들어 30K 필터에 항체 용액을 걸어주고 교체할 버퍼로 계속 흘려주면(Centrifugation)항체는 필터에 걸려있고 기존 버퍼는 희석되며 흘러가서버퍼 교환이 될 텐데왜 다른 방법을 사용하는지 궁금합니다.
회원작성글 절미절미짱절미  |  2018.10.29
Q. BL21(DE3)를 cell lysis시 protease inhibitor를 꼭 넣어주어야 할까요?
현재 BL21(DE3)를 이용하여 단백질 발현을 하고 있습니다.발현 후 cell lysis과정에서 protease inhibitor를 사용하는데, 제가 찾아보니 BL21의 경우 protease defective strain이라고 되어 있어서요그러면 protease를 생산하지 않으니 cell lysis시 구지 protease inhibitor를 넣지 않아도 되지 않을까 해서요
회원작성글 강영임  |  2018.10.19
Q. protein lysate 만들 때에 사용하는 PROPREP 질문있습니다 ! 첨부파일
안녕하세요! 저는 U937 cell을 이용하여 cell lysate 만들어서 western을 하고 있는 대학원생입니다. 제가 develop 하고 나면 U937의 ctrl 군에서 세로로 까맣게 펜으로 그은 듯한 모양이 나타납니다. 예전에도 글을 한번 올린 적 있는데 일단 b-actin 밴드의 확인으로 protein을 ctrl군에 많이 넣었을 가능성은 배제하였고 댓글에서 그 군이 과발현 했을 가능성에 대해 말씀해주시더라구요. 궁금한 것이, 저희 연구실에서는 RIPA lysis buffer와 intron사의 PROPREP을 이용하여 protein lysate를 만들고 있고, 원래는 보통 cell lysate 만들 때에는 RIPA lysis buffer를 많이 이용하고 조직에서 protein을 만들 때에 PROPREP을 이용하고 있습니다. 근데 저는 protein determination하면 조금 낮게 나와서 PROPREP으로 뽑고 있는데,혹시 PROPREP에 의해서 cell lysate가 과발현할 수 도 있나 궁금합니다. intron사의 홈페이지에 들어가서 PROPREP에 들어가는 reagent들을 확인했지만,잘 모르기도 하구요 ㅠㅠ 어떤 성분에 의해서 cell lysate 자체가 과발현할 수도 있는지 아시는 분 있으면 알려주세요!감사합니다 ~ 
회원작성글 집수닝  |  2018.10.18
Q. cytosol/nuclear fraction 질문이 있습니다.
rat muscle tissue 에서 cytosol/nuclear fraction을 진행 했습니다.웨스턴 분석을 통해 확인은 해봐야 하나 cytosol fraction은 잘 된 것 같습니다.하지만 nuclear에서 protein 농도가 너무 낮게 나오네요.20ug loading 기준 한 well에 2x dye 포함 42.64ul을 loading 해야 하는 상황이 생겨버렸습니다..lysis 단계에서 제대로 되지 않은 건지... cytosol fraction을 진행 한 후에washing은 3번 진행했습니다. 뭐가 문제점 인지 도통 모르겠네요..혹시 좀 더 pure하게 nuclear fraction을 얻을 수 있는 방법이나 팁이 있을까요??
회원작성글 solK  |  2018.10.17
Q. 단백질 추출
1. SDS-PAGE를 통해 단백질을 분리하면 단백질의 3차 structure가 풀리게 됩니다. 그런데 저는 완전한 3차구조의 단백질을 얻고 싶은데 이럴 때는 어떤 방법을 써야하나요? SDS방법 말고 다른 방법이어도 상관 없습니다. 2. 혹시 음식에서 제가 원하는 단백질을 뽑아낼 수 있나요? 
회원작성글 퉁기퉁기  |  2018.10.09
Q. protein의 농도가 낮아 농축하고자 하는데 도움좀주세요
지금 진행하는 실험이이 cell에다가 어느 농도의 물질을 처리하니까 cell의 viability가 너무 낮아서단백질을 뽑아 실험을 진행하는데에 어려움이 있습니다.BCA 정량을 하면 수치가 낮아서 sds로딩을 할때 30ug/40ul를 해도 간혹가다가 안되는 경우가 생깁니다단백질을 농축하는 방법이 있으면 해보고싶은데 찾아보니 TCA랑 Ammonium sulfate방법같은게 protein precipitation으로 있더라구요궁금한게 저는 cell에다가 lysis buffer랑 pi를 투여해서 scrapper로 긁은다음에 그걸 centri 돌리고 상층액을 따서 protien을 얻는 방법을 사용하고 있습니다. 이상태에서도 precipitation 방법을 사용할 수 있나요??Ammonium sulfate 방법은 포화된 용액을 만들어서 전체용량의 70%가 되게 한다음에 centri를 돌려서 침전물이 protein이라고 공부를 하였습니다.이를 토대로 실험을 진행해봤는데 salt가 떠있는게 보이기는 하는데 centri를 10000rcf 20min을 해도 잘 가라앉지를 않더라구요처음부터 lysis buffer + pi의 양을 줄여보는것도 해봤고 plate를 늘려서 양을 늘려보기도 했는데 농도가 낮아서 고민입니다 ㅠㅠ저좀 도와주시면 감사하겠습니다. 실험이 재연성을 진행하는 실험이라 농도를 바꾸기는 쉽지않고이미뽑은 농도가 낮은 protein 을 농축시킬 수 있는 방법이 있으면 좋겠습니다.
회원작성글 쎌뿜뿜  |  2018.09.17
Q. western blot을 위한 sample preparation중에 질문이 있습니다.
muscle tissue에서 protein extraction을 계획 중에 있습니다.처음 혼자 하는 실험이고 알려줄 사람이 없어 궁금한게 많은 초보 실험생 입니다..충분한 study를 통해 정확한 실험을 하고 싶어 manual로 진행을 하려고 하며protocol은 어느 정도 구성을 해놓았는데 homogenize buffer의 선택에 있어 많은 어려움이 있네요..여러 homogenize buffer와 buffer 구성 성분의 각 역할 그리고 보고자 하는 protein에 따라 다른 buffer에 대해 궁금한게 많습니다. 이 부분에 대해 자세하게 설명이 되어있는 자료가 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 solK  |  2018.09.17
Q. Protein 추출시 DNA와 RNA는?
tissue에서 protein 추출시 그냥 lysis buffer로 잘 갈은뒤,centrifuge를 하게되면 제일 위에 지방층, 가운데 protein, 밑에는 세포 부산물(찌꺼기)가 남아서가운데의 protein을 그냥 새 tube에 옮기는 방법은 이해가 되는데요..여기서 의문점이 들어서요.위에 말한 3가지의 층중에 DNA와 RNA는 어디에 있게 되는건지 여쭈어봐도될까요?
회원작성글 쥐돌이아빠  |  2018.09.03
Q. protein extraction 관련해서 질문드립니다.
rat에서 casting을 한 후에 muscle atrophy를 일으켜운동을 시킨 후에 회복을 보는 실험을 계획 중입니다.혼자서 하는 실험이 처음이라 western을 하기 위한 sample을 만드는 과정에서protein extraction(cytosol)을 하려고 합니다. DNA나 RNA는 따로 분석을 하지 않기 때문에cytosol 수준에서 분석을 하기 위해 protein extraction에 몇가지 궁금한게 생겨 글 남깁니다.질문 1. protein extraction이 preparation과 같은 의미로 사용되나요??        preparation은 실험을 위한 사전 준비를 통걷는 말인가요??        같은 실험에 계신 분이 preparation은 잘되가냐고 물어보시길래 헷갈려서 그렇습니다.        (이 분이 extraction의 의미로 사용한 것은 확실합니다)질문 2. lysis buffer는 hepes buffer를 사용하려고 하는데 보고자 하는 단백질에 따라        사용하는 buffer가 다른가요?? 아니면 약간의 tip같은 것인가요??        사용되는 inhibitor가 다른 건지 궁금합니다.       (물론 비슷한 실험을 한 논문을 찾아보고 진행하겠으나 논문마다 방법이 다르더군요)질문 3. 관련 자료들을 찾아보면서 용어적인 부분에서 혼동이 많이 오는데          protein extraction과 homogenize, 그리고 preparation과 lysis buffer에 대한         구체적인 설명을 해주신다면 감사하겠습니다.질문 4. 혹시 제 실험과 관련해서 적절한 buffer나 protocol 혹은 tip이 있으면          조언 해주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 solK  |  2018.08.28
Q. Dialysis(solid AS or liquid AS)
안녕하세요 브릭 여러분.특정 단백질을 Ammonium sulfate로 침전 하는 중인데 궁금한 점이 있어 질문 드립니다.목적하는 단백질 외에 impurity를 제거 하기 위하여 AS를 10~80%까지 테스트를 하였는데이상할 정도로 target protein만 침전물 & 상등액 어디에도 존재하지 않고 있습니다.기존에 알고 있는 상식과 다른 점은, solid AS를 10~80%까지 treat 한 것이 아니라100% AS를 liquid로 만들어서 10~80%까지 처리하였습니다. 2번 테스트 하였는데 2번 모두 target protein만 사라지는 결과를 얻었고, 나머지 impurity는 상등액 또는 침전물에 모두 있는 것을 확인하였습니다.질문 요지는;1) solid AS와 liquid AS를 treat 하는 것이 차이점이 있는지?2) AS에 의하여 target protein만 사라지는 현상은 발생할 수 있는지? 궁금합니다.미리 답변 주신 분들께 감사 인사 드립니다.
회원작성글 sein  |  2018.08.27
Q. 유전자 재조합한 recombinant cloning plasmid 플라스미드 양을 늘리는 방법이 뭔가요?
효소를 발현하여 이용하는데 대량발현이 잘 안되어서 형질전환을 여러번 해보다보니 재조합 플라스미드가 빨리 닳아서요매번 클로닝을 맡길수가없는데 방법이 있다고 들었습니다만 제 선임도 모른다네요 ㅠㅠ 방법이라도 키워드라도 알고싶습니다. 
회원작성글 Trolli  |  2018.08.17
Q. 시약회사마다 RIPA buffer 값 차이가 엄청나네요...
단백질 얻는데에 pre-prep 사용하다가 RIPA buffer로 잠시 바꿔보려고 합니다.근데 RIPA buffer 시약값 차이가 엄청나네요어떤데는 500ml에 3 만원대이고, 어떤데는 50ml에 11 만원이고...그래서 이상한 것으로 고민에 빠졌습니다... =ㅅ=싼거 사도 괜찮을지... 아니면 비싼거 살지...왜 이렇게 값 차이가 많이 날까요?여러분은 어디 회사꺼 쓰시나요?
회원작성글 뜻  |  2018.08.07
Q. RIPA 10X buffer 엘리컷 할때 침전물이 뭘까요 .. ㅠㅠ
안녕하세요! 도와주세요 고수님들.. ㅠㅠ 저희 교실은RIPA buffer 10X짜리 100ul씩 엘리컷하여 -20도에 보관합니다. Cell signaling 회사 제품을 쓰는데, RIPA buffer를 냉장고에서 녹인 후, 거의 곧바로 엘리컷을 진행했습니다. 거의 끝날때쯤 밑에 침전물 덩어리진게 있어서 찾아보니, SDS가 낮은온도에 의해 결정형으로 나타난다고 하더라구요! 이런상황에서 만들었던거 다시 빼서 녹인 후, 다시 엘리컷 해야할까요? 그냥 그대로 사용해도 괜찮을까요 ㅠㅠ? 부탁드립니당... ㅠㅠ
회원작성글 nanajina  |  2018.07.27
Q. sonication시 거품 발생 원인 및 해결방법 첨부파일
현재 E.coli에서 protein을 정제하기 위해서 그 첫단계로 sonication을 하고 있는데요문제는 아래 첨부화일처럼 5~6초만 sonication을 시켜도 거품이 난다는 겁니다.거품이 발생하면 단백질 활성도가 낮아진다고 알고 있고, 이렇게 거품이 생긴 것을 최종적으로정제하여 활성도 테스트시 활성이 실제로 떨어졌습니다.거품이 나는 원인과 해결 방법 좀 알려주세요저는 lysis buffer로는 50mM Tris, 500mM NaCl, 10mM immidazole, pH 8.0을 사용하고 있습니다.
회원작성글 강영임  |  2018.07.27
Q. protein extraction이 안됐어요..
6Well에 DPBS넣어서 washing 해주고, lysis buffer 넣고 얼음 위에 10분간 두면서 한번씩 흔들어주고 스크래퍼로 긁어 담아서 7000rpm에서 9분해서 찌거기 버리고 다했는데 stainig 했더니 밴드가 안나왔어요ㅠㅠ 뭐가 문제였을까요.. 도와주세요ㅠㅠ
회원작성글 ene  |  2018.07.18
Q. nuclear extract 첨부파일
안녕하세요 현재 RAW264.7을 가지고 NF-kB를 보고있는 학생입니다.다름이 아니라 제가 몇달동안 이 실험을 진행해도 진척이 없어서 질문을 올리게되었습니다.Buffer A: 10mM HEPES, 10mM KCL, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 4ug/ml Aprotinin, 2ug/ml Pepstain Buffer C: 10mM HEPES, 50mM NaCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 0.1% IGEPAL, 1mM DTT, 1mM PMSF, 4ug/ml Aprotinin, 2ug/ml Pepstain Buffer A를 이용하여 pellet을 washing후에 centrifuge를 돌린다음 상등액 제거한뒤 buffer c 주입를 주입하여 염농도 차이로 핵을 깨는데 Western blot을 해보면 핵내만 존재한다는 단백질인 Lamin B는 거의 발현되지않고 NF-kB만 잘나옵니다.(사진첨부, 사진은 흰색밴드 밑에가 Lamin B로 추정하고 있습니다. NF-kB의 사진은 따로 첨부하지 않았습니다.) 저는 이게 핵이 분리가 덜되어서 NF-kB의 경우는 Cytosol과 섞여있어서 잘나오지만 Lamin B는 핵분리가 덜되서 잘 안나온다고 생각합니다. Buffer나 method중 어느부분이 잘못되었는지 알려주시면 감사하겠습니다.또 여러 고수님들의 실험방법을 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 가나다라abcd  |  2018.07.18
Q. 피부 각질층에서 단백질을 얻고자 합니다.
피부 각질층을 테이프로 떼어내어내서얻어진 각질층에서 단백질을 얻고자 하는데요.기존에는 RIPA buffer를 이용해서 단백질을 얻었는데요.(저도 전해 듣기만 해서 이 buffer를 사용하는 것이 맞는지 의문입니다.)찾아보니 단백질 종류별로 사용하는 buffer가 너무 많아서 어떤 것을 사용해야 할지 모르겠습니다.만약 전체적인 프로토콜이나 논문이 있다면 공유해 주시면 너무 감사하겠습니다. 단백질 전문가 분들 답변 부탁드립니다. 
회원작성글 micro_sol  |  2018.07.17
Q. 혈액에서 베타아밀로이드 전처리 과정이 궁금합니다.
안녕하세요~저희 실험실에서 저온 보관된 혈액에서 베타 아밀로이드(단백질)을 전 처리를 통하여 확보 하려고 합니다. 구글에 찾아보아도 어떤 방법을 써야할지 도통 감이 안오내요...ㅠㅠ저희 실험실에 혈액관련 아시는 분이 한명도 없어서;;; 어떤 전처리 법이 있는지, 베타 아밀로이드를 전처리 하는 방법이 따로 있는지, 키트를 따로 판매하고 있는지 ㅠㅠ 답답하여 질문드립니다..ㅠㅠ
회원작성글 yeonyP  |  2018.07.16
Q. 마우스 간조직에서의 lysate 프로토콜을 알고싶습니다!
마우스 간조직에서 TISSUE LYSATES로 웨스턴 블로팅을 처음해보게 되었습니다.혼자 하는 연구이고 주변에 물어볼 사람이 없어서 기초적인거겠지만 이렇게 기초 질문 드립니다...여러 페이퍼들을 찾아보았지만 "랩"만의 프로토콜을 공유하진 않아서요... 부탁드리겠습니다주변에 도움 받을 곳이 없어서 염치불구하고 간절히 여쭤봅니다.보유하고 있는 RIPA Buffer는 biosesang 제품으로 조성은NaCl : 150mMTritonx-100 : 1%sodium deoxycholate : 1%sds : 0.1%Tris-HCI,pH7.5 : 50mMEDTA, pH 8.0 : 2mM이렇습니다만 개봉후 1년이 넘은 것 같습니다.protease inhibitor를 첨가해야 되는 걸로도 알고있습니다만 아직 protease inhibitor는 미비상태입니다.몇 mg의 간조직에 얼만큼의 buffer가 필요하며, protease inhibitor가 얼만큼 필요한지, 추천해주시는 시약들이 있는지 여쭤봅니다.너무 기본적인 질문올려 죄송하지만 부탁드립니다 감사합니다
회원작성글 앙재문  |  2018.07.12
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