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BioLab 최수진 교수
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 카테고리: 전체 > Microbiology > Yeast
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Q. PFGE
PFGE 실험에 한참 열을 올리고 있는 중입니다..실험을 해서 제가 원하는 패턴을 찾아 냈지만 데이터가 깨끗하게 뽑아 지지 않아서 고수분들의 도움의 받고자 올립니다.현재 yeast를 가지고 하고 있습니다. 균주를 사서 한건 아니고 해수에서 얻은 균주 입니다.첫번째가 ladder이고 두번째 세번째가 제가 가지고 있는 균주 입니다.chromosomal DNA 를 볼려고 합니다. buffer는 TBE buffer를 사서 0.5X 로 희석을 해서 사용했습니다. agar는 Bio-rad PFGE 전용 agar를 사용 했습니다.6V30시간 120도 intial switch time 1min final switch time 2min처음엔 current 값이 끝날때쯤 보니 200이 좀 안되는 정도 였습니다. current 값이 좀 높으면 그럴수도 있다 하여 V 값과 각도와 시간을 조절 하여  current 값을 50~90 사이를 맞추고 끝날때쯤 100이 살짝 넘는 정도였는데 똑같이 밴드가 smear되었습니다.current 값을 낮춰서 실험을 해봤는데 문제 해결을 하지 못해 .. 다른 방법을 찾아봤습니다.제가 분리 하고자 하는 DNA size가 2,2~0.5 mbp정도 됩니다TBE는 TAE에 비해서 current 값이 낮게 시작할수 있지만 DNA가 내려가는 속도는 좀더 느리기 때문에 큰 size를 분리 할때는 TAE로 하는 경우도 있다고 했습니다.그래서 1XTAE buffer를 가지고 PFGE를 했고 역시 비슷할 결과를 얻었습니다.   6V120도23hrinitial switch time 59secfinal switch time  2min 55sec이렇게 setting을 하니 current 값은 300에서 시작했고 390정도 에서 끝났습니다. 중간에 current 값이 너무 올라 가는거 같아서 buffer를 한번 교체해줬습니다.결과는 여러번 했던 실험과 비슷하게 smear 되었고  오히려 current 낮은 데이터가 더 안 좋게 나온 경우도 있었습니다. 모든 실험은 14도씨, pump speed는 70을 맞추고 실험 했습니다..그리고 current 값을 낮추기 위해 온도를 12도씨 까지 떨어 뜨려 봤지만 결과는 비슷했습니다. 여러번 실험을 하지만 뭐가 문제인지 갈피를 잡지 못했습니다. 처음엔 yeast sample만 pulg로 만들어서 걸었을때는 plug을 잘못 만들어서 인줄 알았지만.. 추후에 ladder와 같이 걸어 보니 ladder 마저도 밴드가 퍼져서 나옵니다. 밴드가 좀더 샤프하게 나와야지 chromosomal DNA가 몇개인지 사이즈가 어느정도 되는지 파악이 되는데 제 데이터 가지고는 이것들이 파악이 되지 않습니다.혹시 다른 방법이나 이유를 알고  계시는 분은 저에게 조언을 주세요 ~~~ 
PFGE  |  2011.11.18
Q. cell 오염에 관하여
2번째 사진은 cell을 풀고 다음날에 확인한 모습인데요  동그라미 안에 보이는 덩어리가 잘 움직이더라구요   처음에는 cell이 뭉쳐 있는건지 알고 원심분리로 다운시킨후   배지를 넣었습니다.1번째 사진   배지를 넣은 후 셀을 푼 사진인데요     동그라미 안에 있는 것처럼 모가 오염되어 보입니다ㅠㅠㅠ 추정으로는 yeast 인거 같은데 맞나요?ㅠ 이게 몬지 혹시 알 수 있을까요? 혹시 오염될 때 plask가 상태가 안좋아도 오염이 잘 되나요? 다른 원인은 없는 거 같아서요 ㅠ
우이우이  |  2011.11.02
Q. colony 가 액체배지에서 자라지 않아요ㅠ
안녕하세요클로닝때문에 겔겔거리고 있는 비루한 학부입니다.다름이 아니고 colony 가 액체배지에 배양할때 자라지가 않아서요ㅜcolony수가 많은것도 아니고....colony들은 모두 colony PCR  을 통해 밴드를 확인한 후 액체배지에 배양을 시켰는데,자라지 않아요ㅜ항생제도 알맞게 처리하였고.... 벌써 24시간이 지났지만 자라지 않습니다.참고로,제가 사용하고 있는 벡터는 피키아 백터인 pPIZa 백터입니다.이스트에 transformation 단계는 아니고, 대장균에 일단 집어넣는 단계입니다.단비와 같은 충고좀 주세요ㅜ2달째 머리가 숭덩숭덩 빠지고 있어요ㅠ
회원작성글 고미곰  |  2011.10.10
Q. 효모 염색 시약 관련 질문입니다. 답변 부탁드립니다.
안녕하세요, 막걸리를 연구하고 있는 대학원생 김보라 입니다. 막걸리에 있는 효모의 세포막을 물리적인 충격을 가해 손상시켜 염색해서 위상차현미경으로 관찰하려고 합니다. 제가 알고 있는 시약은 phloxin B(sigma Co.) 입니다. 이 염색시약을 대체할 수 있는 시약에는 무엇이 있을까요?꼭 알려주세요. 부탁드립니다.
김보라  |  2011.09.27
Q. 퍼멘터 컨탐...
안녕하세요퍼멘터를 이용하여 발효실험을 하는 석사생입니다.다름이 아니고 이번에 퍼멘터에서 고온으로 당화 후에 온도를 낮춰 효모를 접종하여 발효시키는 실험을 하는데당화 과정에서 12시간만에 에어나가는 부분이 컨탐되었습니다.컨탐이라는게 발효조안에 시료들이 에어나가는 부분, 즉 냉각수 안쪽에 동글동글한 곳까지 역류하였습니다.....퍼멘터도 익숙치않고 이런 적 또한 처음 인지라 도통 원인을 모르겠습니다..같은 방법으로 이전에 실험하였을 때는 이러지 않았는데..이전 실험과 다른점은 당화효소의 농도가 좀 더 높아서 당화가 조금 더 빠르게 진행되었을 것이란 예상입니다..알피엠은 같게 350정도엿구요..무엇이 문제인지 모르겠습니다..퍼멘터 컨탐 원인이 어떤 것이 있을지 문의드립니다ㅠㅠ
ㅠㅠ  |  2011.09.26
Q. yeast, mammalian vector
1) yeast vector는 yeast plasmid를 이용하여 vector구축하는게 맞는건가요?2) 그럼 mammalian expression vector가 무엇인지 기초부터 좀 설명해주세요.... 무엇인지 전  혀 감이 안오네요...그리고 3) 이것을 transformation시킬 때 사용하는 균주가 yeast vector이면 yeast를 사용해야 하는건가요...?;;**yeast, mammalian vector에 대해 자료 얻을 수 있는 곳이나 서적도 알고계시면 추천좀해주세요
회원작성글 question  |  2011.09.13
Q. yeast medium
yeast culture 를 하고 있는대 배지어떤걸 써야 할지 모르겠네요..실험실에서 쓰는 GPYA를 썻을 때 yeast가 잘 자라지 않습니다....yeast medium 에 대해서 알려주실분 안계신가요 ㅜㅜ논문 찾자하니 시간이 너무 쪼달려서 ㅜㅜprotocol이나 배지 종류 관련 논문이라도 좋습니다 ㅜㅜㅜ부탁드립니다 ~~~다들 즐겁고 행복한 하루 되세요
회원작성글 그만부려먹어요  |  2011.08.03
Q. 추출한 DNA 색이 노란색???
안녕하세요.MRS broth에서 자라고 있는 colony(젖산균, 효모)를 각각phenol-chloroform extraction 기법으로 DNA를 추출했는데요.맨 마지막에 DNA pellet 색이 노란색인데요. 이럴 수도 있나요?ds-DNA의 색이 노란색이라는거 같긴 한데.예전에 DNA 추출 실험했을 때는 흰색이었던거 같아서요...PCR을 하다보니 결과가 안나와서 DNA 추출에 문제가 있지 않았나 의심이 됩니다. 답변해주세요.ㅠㅠ
회원작성글 DNA 추출자  |  2011.07.13
Q. 음...님에게 여쭤봅니다~
제가 6월 29일에 yeast two hybrid와 IP에 관련되서 질문드린적이 있는데답변해주신 내용 중에 폴스파이지트가 무었인지요??찾아봤는데 잘 못 찾겠더라구요...그리고..답변 감사드립니다^^
IPs  |  2011.07.01
Q. buffer filteration 할때 0.2um 필터용지를 쓰는 이유는 무엇인가요~?
이스트를 키우기 위해 버퍼를 만드는데,버퍼 필터링을 할때는 0.2um용지를 사용한다고 하더라구요혹시 특별한 원리나 이유가 있나요!??
회원작성글 메바  |  2011.06.24
Q. 각 세균을 분리하여 배양
세균을 배양 하는데 서로 구역을 나눠서 배양해야 하는게 있고 또 그렇지 않아도 되는 것이있는 걸로 아는데 어떤 세균 종류가 있는지, 그리고 어떤 것들은 서로 같은 공간에 두면 오염되는지가 궁금해요.(예를드면 박테리아인 대장균과 진균인 이스트는 같이 배양 못함)
세균  |  2011.06.02
Q. 생물학의 골칫덩이들
실험을 하다보면 항상 고민이 생겨요. 그리고 그런 고민거리들은 잘 해결되지도 않네요RNA는 연약한 반면 RNAse 강하고, DNA는 강하지만 Nuclease도 강하고Protein은 상황에 따라 다른데 Protease는 하나같이 강하고endotoxin도 강하고, yeast도 쉽게 다른 것들을 오염시키고, autoclave에서도 살아남는 애들도많고 ..왜 하필 바이오만 이렇게 골칫거리가 많은 건가요?
고민  |  2011.05.26
Q. 효모의 centromere 찾는법 알려주세요!!
제목 그대로 입니다..효모의 centromere가 무엇인지는 검색으로 많이 알게됬는데이 것을 찾는법은 도통 알 수가 없네요..도와주세요!!
냥냥  |  2011.05.17
Q. pQE80L vector 분양 혹은 교환
카이스트 내 계신분이 더욱 좋습니다. 제가 가진 vector는 pTrc99a, pET28a 입니다. 전화: 010-5385-3672이메일: koguma74@gmail.com
회원작성글 koguma74  |  2011.05.13
Q. 효모 ADH 아미노산 sequence 어떻게 찾죠?
안녕하세요, 분자생물학을 공부하고 있는 학생인데요,이번 실험에서 효모의 ADH를 purify 하게 되었는데yeast ADH의 amino acid sequence가 리포트 쓰는데필요한데 어떻게 찾아야 하는 지 잘 모르겠어요.도움 좀 부탁드릴게요 ^^;
회원작성글 튜베로즈  |  2011.03.31
Q. MacConkey배지 질문
MacConkey 배지로 gram +/- 를 구분하는 실험을 하려고 합니다.미생물은 흙이나 김치 같은 주변에서 구할 수 있는 sample에서 채취를 했구요,staining으로 gram +/-를 구분해 놓은 상태입니다.그래서 MacConkey 결과와 일치하는지 확인하는 실험을 하려고 하거든요.그런데 수업전에 제가 미리 해 보려고 몇번째 하고 있는데, 아무리 조건을 바꾸어 줘도 미생물이 자라지 않습니다.그래서 제가 만든 MacConkey 고체 배지에 E.coli를 키워봤는데, E.coli는 잘 자러다구요..;그래서 생각해 보건데 E.coli는 워낙 최소한의 조건만 갖춰지면 잘 자라는 놈이라서 MacConkey에서도 잘 자라지만 흙이나 김치에 있는 미생물은 그렇지 않을 지도 모른다는 생각이 들었습니다.MacConkey 배지에는 yeast extract 같은 먹을 거리가 들어 있지 않으니까요..;그래서 어떻게 할까 생각하다가 MacConkey와 LB를 섞어서 배지를 만들어 볼까 까지 생각했거든요..; 이렇게 만들어 gram +/-가 구분이 될까요? 다른 문제가 생기거나 하지 않을까요? 실험하기 전에 문제가 없을지 조언을 구하고 싶어서 질문 남깁니다.답변 부탁드립니다.
학생  |  2011.03.25
Q. 업체 문의 드립니다
균주는 Yeast며 세포 분석 가능한 업체 부탁드립니다.cell을 깨서 내용물 분석 및 세포외 분비물 분석이 가능한 업체를 알고 계신 분들은 알려주세요010-3595-9429 (jooz81@nate.com)이나 답글로 남겨주시면 연락드리겠습니다.
주엠느  |  2011.03.09
Q. pcr시 컨탐과 pcr 조건 궁금합니다
저는 이제 대학원을 진학하게되서 아주 초보입니다;다른게 아니라 여태 잘 되어 오던 pcr 과 cloning 이 되지 않아서 너무 답답하고 해서 이렇게 질문하게 되었습니다. 1. pcr 시 프라이머에 넣는 물이 컨탐이 되었을 경우에도 원밴드가 깔끔하게 제 사이즈에 딱 맞게 나올수도 있는건지 궁금합니다.2. pcr 을 하고 젤을 봤을때 밴드가 적어도 5개이상 나오는 경우가 있었는데DMSO 첨가도 하고 온도도 변화를 주었지만 여전히 pcr 은 되지 않고 있습니다.primer 를 다시 짜야 하는걸까요?또, 아예 밴드가 나오지 않는 경우도 있어요;;; 워낙 크기가 작은것들이라 , primer 짜는것도 한계가 있는데다가 domain 정보도 없어서저한테는 디게 힘드네여, ㅠ primer 잘 짜는 법 도 알려주시면 정말 감사하겠습니다.3. transformation 후에 colony 를 따서 miniprep 후에 일루션을 보면 투명하지 않고 흐릿한 색을 띄고 insert 도 없습니다. 제 생각엔 컨탐이 된거 같은데 대체 어디서 컨탐이 되었는지 알수가 없습니다. 엔자임도 새로 썼고 팁도 멸균한지 얼마 되지 않은것을 썼고, 다만 miniprep kit 만 실험실원들과 함께 쓰구요;;miniprep kit 은 아무 문제가 되지 않는다고 생각됩니다 , 왜냐면 이미 그전에 컨탐이 되었기 때문에 LB 상에서 대장균보다 더 많이 자라는게 아닐까요?제 생각엔 plate 상에서 대장균과 별 다른게 없었으므로 yeast  인것 같습니다. primer 에 컨탐된 물을 넣었을때 이러한 현상이 생길수도 있나요?제발 알려주세요,,,,ㅠㅠ
회원작성글 리즈sS  |  2011.02.27
Q. DNA isolation from Yeast 첨부파일
Yeast two hybrid screening을 하고 있는 학생입니다. HindIII로 반응시킨 후 candidates를 찾는 과정에서 prey가 잘 나오지 않아Yeast에서 DNA prep 후의 DNA의 문제가 있는지 확인하기 위해 전기영동을 해보니 사진과 같이 나왔습니다.제가 보기엔 DNA가 깨진 것 같은데..ㅠㅠ제가 잘못한 부분이 어딜까요?ㅠ아래는 DNA isolation 과정을 정리한 것입니다. <DNA isolation from Yeast>1. 1.5ml micro tube에 1.5ml 씩 분주. 2. RT에서 12,000rpm으로 30sec동안 centrifuge. 3. 일부 상등액을 제거(tube를 뒤집어서 상등액이 떨어지도록함. 심하게 털어내지 말 것, 약 50ul 정도 남김) 후 residuel liquid로 voltexing에 의해 pellet을 suspension. 4. Yeast lysis solution 200ul 첨가. 5. phenol/chloroform/Isoacyl alcohol(25:24:1) 200ul과 acid washed glass bead 0.25~0.3g 첨가. 6. 2min 동안 voltexing (maximum speed) - para film으로 sealing - 2개씩 짝을 지어서 1min 하고 다른 2개 1min하고 번갈아 가며 2min씩. 7. RT에서 5min 동안 13,200rpm으로 원심분리. -sealing 한 것 풀고 centrifuge. 8. 새 tube로 상등액 200ul을 옮기고 3M sodium acetate 20ul 첨가후 살짝 voltexing 하여 mix. 9. 100% ethanol(-20’C) 1ml을 첨가하고 inverting 후 ethanol precipitation.  -deep freezer에서 적어도 1hr이상 reaction. 10. centrifuge(RT,10min,maximum speed) 후 상등액 조심스럽게 버리고 700ul 70% ethanol로 wash, centrifuge(RT,5min,maximum speed) 10. 상등액 버리고 spin down(30sec) 후 suction으로 수분제거 후 약 20min air dry. 11. DNA pellet을 ultra pure water(UPW) 50ul로 elution 후 3M sodium acetate 5ul를 첨가 후 살짝 voltexing mix.  12. 100% ethanol(-20’C) 150ul 첨가 후 deep freezer에서 1hr reaction.  13. centrifuge(RT,10min,maximum speed) 후 상등액을 조심스럽게 버린 후, 700ul 70% ethanol(-20’C)로 wash, centrifuge(RT,5min,maximum speed)  14. 상등액을 버리고 spin down(30sec) 후 suction으로 잔여수분 제거 후 약 20min동안 air dry.  15. “11~14번” 과정 1회 더 수행함. 16. -20’C에 보관. -> elution은 실험하기 바로 전에 10ul에 elution.   ※ Lysis solution (100ml) 20% Triton X-100                 2ml 1% SDS             10% SDS    10ml 100mM NaCl        1M NaCl    10ml 10mM Tris(pH8.0)    1M Tris      1ml 1mM EDTA          0.5M EDTA  200ul
학생  |  2011.02.23
Q. haemavytometer
haemacytometer로 효모수를 측정하려고 하는데..haemacytometer위에 cover glass 올리고 측정 sample을 도말하여 바로 측정하였는데눈금이 보이지가 않습니다현미경 배수를 높여도 희미하게 보이거나 또는 보이지 않는데..측정시어떤 다른 방법이 있는지??
지니  |  2011.02.11
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