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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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Q. BCA 방법으로 protein 측정할때 첨부파일
브래드포드 방법으로만 하다 처음으로 BCA 방법으로 단백질 정량을 하려고 보니 의문점이 생겼는데요. Q1. 96 well plate에 standard 와 sample을 동량으로 넣어야 하나요.. protocol에 보면 [ Pipette 25 μl of each standard or unknown sample replicate into a microplate well (working range = 20-2,000 μg/ml). Note: If sample size is limited, 10 μl of each unknown sample and standard can be used (sample to WR ratio = 1:20).] 라고 되어있어서 standard 와 sample 각각을 25 ul, 10ul 넣고 해봤는데요. 너무 다른 값이 나와서 대체 어느 값을 써야할지 모르겠어서 이렇게 문의글을 남깁니다. 제가 측정해서 엑셀로 정리한 것을 첨부하였습니다. sample은 1/10, 1/20 으로 dilution 했습니다.  
회원작성글 cherrywood  |  2019.03.05
Q. Ponceau S staining
Western blot을 처음하고 있습니다. 최근에 Tubulin을 염색을 했는데 band가 나왔습니다.그런데 이상한 점이 ponceau s staining이 되지 않습니다. 아는 분에게 protein을 받아서 positive control로 걸었는데 그분 것만 ponceau s staining이 됩니다.다른점은 그분은 30ug, 제 protein들은 7ug을 로딩했다는것 하나입니다.RIPA buffer를 PBS wash된 cell에 처리하고 pipetting을 한후에 sample buffer와 섞어서95도에서 10분 끓였습니다. 그후에 로딩을 했는데 혹시 빼먹은 부분이 있나요?
회원작성글 연연  |  2019.02.06
Q. SDS PAGE 에 관해 여쭤봅니다. 선배님!!
이번에 처음 SDS-PAGE를 해본 학부생입니다.. 여쭤보고 싶은것은 선배님이 노트정리 하신것에선 gel을 만들때 (stacking gel, running gel)d.w/ 30% monomer /  tris / sds/ aps / temed 를 한번에 넣는것으로 되어 있고 제가 찾아본것은 tris/ sds/d.w 로 mixer를 만든 후에 나중에 나머지를 넣는다고 나와있는데특별한 이유가 있나요?? 아니면 단순히 gel의 비를 맞추려고 하는 건가요?? 그리고 stacking gel 과 running gel 을 각각 만들때 tris의 몰농도도 다르게 설정하던데 이것도 단순히 gel의 비를 맞추기 쉬우려고 한건지... 마지막으로 10% Acrylanmide gel의 protocol도 알려주시면 감사하겠습니다.. + 추가적으로 10% Acrylamide로 분리할수 있는 protein의 크기와 5%stacking gel을 이용하면 결과가 잘 나올지 질문드립니다..  
회원작성글 실험실뉴비  |  2019.01.14
Q. pET vector를 이용한 protein induction
안녕하세요pET vector를 사용해서 원하는 단백질을 induction 조건을 잡고Large scale로 불리는 과정중에 있습니다.Novagen에서 제공하는 pET system에서는 induction 후 어떤 buffer를 사용해야 할지에 대해서 나와있지 않아 여기에 문의를 드립니다.gel staining을 통해서 protein양을 확인하고 Protein을 정제하고자 하는데,이때 cell에서 extraction시 사용하는 buffer와 Lysis할때 사용하는 buffer를 어떤걸 사용하면되는지 알려주시면 감사하겠습니다.또 Novagen이외에의 protocol이 있다면 추천해주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 manuna  |  2019.01.10
Q. 단백질 정제 후 농축 과정에서 활성 저하
안녕하세요 !!단백질 정제 초보입니다ㅜㅜ 현재 FPLC로 단백질을 정제하여 amicon으로 농축하고 있습니다. FPLC fraction sample 농축하기 전과 농축한 후의 activity 차이가 많이 납니다. 농축과정에서 activity를 잃는 것 같은데 ㅠㅠchange buffer에 차이를 줘도 차이가 없습니다. amicon말고 다른 방법으로 농축을 해야하나요 ㅠㅠ?농축과정에서 활성이 줄어드는 단백질은 어떤 과정으로 농축하는 것이 좋을까요 ? ㅜㅜ조언 부탁드립니다.
회원작성글 클로니잉  |  2018.12.26
Q. Cell protein lysis시 pellet이 보이지 않습니다
Cell protein을 lysis 시키기 위하여 RIPA Buffer를 투입하였습니다Cell은 약 1X10^6 cells이고, RIPA Buffer 1ml을 넣어 lysis를 진행하였는데요..4도씨에서 10분씩 섞어주기를 3회 반복한 후 원심분리를 하였습니다.4도씨 13000rpm 조건으로 원심분리 후 튜브를 보았는데 pellet은 없고..상층액을 취하려는 데 불투명한 흰색 점액질이 딸려옵니다 ㅠㅠ세포 상태가 안좋은가 싶어 새로 해동도 시켜보고, 분양도 받았지만 같은 현상이 발생하네요이유를 아시는 고수님 가르쳐주세요 ! 
회원작성글 민소리  |  2018.12.10
Q. 대장균 harvest 하고 20% sucrose로 wash해주는 과정이 어떤 역할을 하나요?
안녕하세요.석사 2년차 대학원생입니다.요즘 어떤 논문을 보고 실험을 하고있는데, 단백질을 정제하기 위해서 대장균을 harvest 하고, 20mM Tris-HCl, pH7.9, 20% sucrose로 washing 해준 다음 다시 lysis buffer로 resuspension 하여 sonication을 진행합니다.저희실험실에서 단백질을 얻으려고 대장균을 파쇄할 때 sucrose washing 과정을 해본적이 없어서 그러는데, 이 과정이 뜻하는게 무엇일까요?가르침 주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 카성  |  2018.12.05
Q. protein extraction할때 중간에 보관하면 degradation이 일어나나요?
안녕하세요? cell에서 protein extraction을 하고 있습니다.lysis buffer cocktail -> sonication -> centrifuge해서 supernatant -> 정량, sample buffer 넣고 끓이기 순으로 진행을 합니다.다름이 아니고 센도리 돌려 supernatant만 -20도에서 일주일 정도 보관하는 것이 protein loss를 일으킬지 궁금합니다. 그 후에 다시 꺼내서 정량하고 샘플 만드려고 하는데요.제 생각은 이미 lysis buffer에 protease inhibitor가 들어가서 괜찮을 것 같은데 실제로는 어떤지 궁금하네요.물론 한번에 샘플까지 만들면 제일 좋지만, 실험을 중간에 끊는 식으로 하면 자투리 시간을 활용하기가  좋아서 그렇습니다.답변 기다리겠습니다~
회원작성글 뷰냐  |  2018.11.28
Q. 균질화시 조직(g) 대 용액(buffer, ml) 비율에 대해 설명해주세요.
안녕하세요.보통 조직 내 효소량을 구할때 완충액과 섞어서 균질화를 하잖아요.저희 실험실 같은 경우는 수산생물을 주로 실험하는데조직 0.1g 에 완충액 0.9ml 을 섞어서 균질화 뒤 원심분리를 진행하는데요.쥐나 토끼 등 실험하는 곳은 비율이 조금 다르더라구요.제가 궁금한 부분은 이 비율에 대해서 왜 그렇게 비율을 주는건지 궁금한데도통 논문에도 자세하게 설명이 나와있지않고생화학 실험책에서도 찾아보기 힘들어서요.제발 미래의 과학발전에 기여하시는 멋진 분들께서저의 궁금증을 풀어주시길 부탁드립니다.자세한 설명이 어려우시다면 약간의 팁을 주시면 따로 공부하도록 하겠습니다!
회원작성글 로켓발사  |  2018.11.15
Q. cell lysis 건조한느낌
저와 같은 경험이 있으신 분이 계실까 하여 (검색을 하다 못찾고) 글을 올려봅니다.. thp-1cell을 culture중입니다 cell lysis를 위하여 plate의 media를 제거하고 -20도에 보관해두고 다음날 lysis를 하는편입니다 protease/phosphatase inhibitor+RIPA 를 이용합니다 그런데 어떤날는 lysis buffer가 plate의 세포에 스윽 잘 스며드는 기분으로 약간은 끈적하게 lysis가 잘 되는거 같은데 어떤날은 마치 물의 표면장력처럼 lysis buffer가 plate의 세포위에 동그랗게 맺히기만 하며, 이를 구석구석 억지로 적셔주고 나서 스크래퍼로 긁으면, 마치 창문에 맺힌 얼음을 긁어내듯이 파사삭 세포들이 떨어져 나옵니다.. 이를 억지로 모아 튜브에 옮기면 1분도 안되서 세포덩어리가 그냥 바로 가라앉아 lysis buffer는 위에 떠있고, 덩어리가 아래 가라앉아있는 상태가 됩니다.. 물론 protein 농도도 없구요... 마치 세포가 -20도에서 건조된건가 라는 생각이 드는데.. 혹시 저처럼 plate째로 -20도에 보관해둔뒤 lysis하시는 분들 중에 이런 경우가 있으셨던 분 계신가요?ㅜㅜ deep freezer에 보관하면 좀 나을까요?
회원작성글 레몬티  |  2018.11.10
Q. 항체(단백질) buffer change에 대한 궁금증
안녕하세요.항체가 녹여져 있는 버퍼를 바꿔주고자 합니다.보통은 desalting column을 사용하거나Dialysis 방법을 사용하더군요.그런데 여기서 궁금한 점이그냥 단순히 생각하면 size filtration 하면 될 텐데 왜 위와 같은 방법을 사용하는지 입니다.예를 들어 30K 필터에 항체 용액을 걸어주고 교체할 버퍼로 계속 흘려주면(Centrifugation)항체는 필터에 걸려있고 기존 버퍼는 희석되며 흘러가서버퍼 교환이 될 텐데왜 다른 방법을 사용하는지 궁금합니다.
회원작성글 절미절미짱절미  |  2018.10.29
Q. BL21(DE3)를 cell lysis시 protease inhibitor를 꼭 넣어주어야 할까요?
현재 BL21(DE3)를 이용하여 단백질 발현을 하고 있습니다.발현 후 cell lysis과정에서 protease inhibitor를 사용하는데, 제가 찾아보니 BL21의 경우 protease defective strain이라고 되어 있어서요그러면 protease를 생산하지 않으니 cell lysis시 구지 protease inhibitor를 넣지 않아도 되지 않을까 해서요
회원작성글 강영임  |  2018.10.19
Q. protein lysate 만들 때에 사용하는 PROPREP 질문있습니다 ! 첨부파일
안녕하세요! 저는 U937 cell을 이용하여 cell lysate 만들어서 western을 하고 있는 대학원생입니다. 제가 develop 하고 나면 U937의 ctrl 군에서 세로로 까맣게 펜으로 그은 듯한 모양이 나타납니다. 예전에도 글을 한번 올린 적 있는데 일단 b-actin 밴드의 확인으로 protein을 ctrl군에 많이 넣었을 가능성은 배제하였고 댓글에서 그 군이 과발현 했을 가능성에 대해 말씀해주시더라구요. 궁금한 것이, 저희 연구실에서는 RIPA lysis buffer와 intron사의 PROPREP을 이용하여 protein lysate를 만들고 있고, 원래는 보통 cell lysate 만들 때에는 RIPA lysis buffer를 많이 이용하고 조직에서 protein을 만들 때에 PROPREP을 이용하고 있습니다. 근데 저는 protein determination하면 조금 낮게 나와서 PROPREP으로 뽑고 있는데,혹시 PROPREP에 의해서 cell lysate가 과발현할 수 도 있나 궁금합니다. intron사의 홈페이지에 들어가서 PROPREP에 들어가는 reagent들을 확인했지만,잘 모르기도 하구요 ㅠㅠ 어떤 성분에 의해서 cell lysate 자체가 과발현할 수도 있는지 아시는 분 있으면 알려주세요!감사합니다 ~ 
회원작성글 집수닝  |  2018.10.18
Q. cytosol/nuclear fraction 질문이 있습니다.
rat muscle tissue 에서 cytosol/nuclear fraction을 진행 했습니다.웨스턴 분석을 통해 확인은 해봐야 하나 cytosol fraction은 잘 된 것 같습니다.하지만 nuclear에서 protein 농도가 너무 낮게 나오네요.20ug loading 기준 한 well에 2x dye 포함 42.64ul을 loading 해야 하는 상황이 생겨버렸습니다..lysis 단계에서 제대로 되지 않은 건지... cytosol fraction을 진행 한 후에washing은 3번 진행했습니다. 뭐가 문제점 인지 도통 모르겠네요..혹시 좀 더 pure하게 nuclear fraction을 얻을 수 있는 방법이나 팁이 있을까요??
회원작성글 solK  |  2018.10.17
Q. 단백질 추출
1. SDS-PAGE를 통해 단백질을 분리하면 단백질의 3차 structure가 풀리게 됩니다. 그런데 저는 완전한 3차구조의 단백질을 얻고 싶은데 이럴 때는 어떤 방법을 써야하나요? SDS방법 말고 다른 방법이어도 상관 없습니다. 2. 혹시 음식에서 제가 원하는 단백질을 뽑아낼 수 있나요? 
회원작성글 퉁기퉁기  |  2018.10.09
Q. protein의 농도가 낮아 농축하고자 하는데 도움좀주세요
지금 진행하는 실험이이 cell에다가 어느 농도의 물질을 처리하니까 cell의 viability가 너무 낮아서단백질을 뽑아 실험을 진행하는데에 어려움이 있습니다.BCA 정량을 하면 수치가 낮아서 sds로딩을 할때 30ug/40ul를 해도 간혹가다가 안되는 경우가 생깁니다단백질을 농축하는 방법이 있으면 해보고싶은데 찾아보니 TCA랑 Ammonium sulfate방법같은게 protein precipitation으로 있더라구요궁금한게 저는 cell에다가 lysis buffer랑 pi를 투여해서 scrapper로 긁은다음에 그걸 centri 돌리고 상층액을 따서 protien을 얻는 방법을 사용하고 있습니다. 이상태에서도 precipitation 방법을 사용할 수 있나요??Ammonium sulfate 방법은 포화된 용액을 만들어서 전체용량의 70%가 되게 한다음에 centri를 돌려서 침전물이 protein이라고 공부를 하였습니다.이를 토대로 실험을 진행해봤는데 salt가 떠있는게 보이기는 하는데 centri를 10000rcf 20min을 해도 잘 가라앉지를 않더라구요처음부터 lysis buffer + pi의 양을 줄여보는것도 해봤고 plate를 늘려서 양을 늘려보기도 했는데 농도가 낮아서 고민입니다 ㅠㅠ저좀 도와주시면 감사하겠습니다. 실험이 재연성을 진행하는 실험이라 농도를 바꾸기는 쉽지않고이미뽑은 농도가 낮은 protein 을 농축시킬 수 있는 방법이 있으면 좋겠습니다.
회원작성글 쎌뿜뿜  |  2018.09.17
Q. western blot을 위한 sample preparation중에 질문이 있습니다.
muscle tissue에서 protein extraction을 계획 중에 있습니다.처음 혼자 하는 실험이고 알려줄 사람이 없어 궁금한게 많은 초보 실험생 입니다..충분한 study를 통해 정확한 실험을 하고 싶어 manual로 진행을 하려고 하며protocol은 어느 정도 구성을 해놓았는데 homogenize buffer의 선택에 있어 많은 어려움이 있네요..여러 homogenize buffer와 buffer 구성 성분의 각 역할 그리고 보고자 하는 protein에 따라 다른 buffer에 대해 궁금한게 많습니다. 이 부분에 대해 자세하게 설명이 되어있는 자료가 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 solK  |  2018.09.17
Q. Protein 추출시 DNA와 RNA는?
tissue에서 protein 추출시 그냥 lysis buffer로 잘 갈은뒤,centrifuge를 하게되면 제일 위에 지방층, 가운데 protein, 밑에는 세포 부산물(찌꺼기)가 남아서가운데의 protein을 그냥 새 tube에 옮기는 방법은 이해가 되는데요..여기서 의문점이 들어서요.위에 말한 3가지의 층중에 DNA와 RNA는 어디에 있게 되는건지 여쭈어봐도될까요?
회원작성글 쥐돌이아빠  |  2018.09.03
Q. protein extraction 관련해서 질문드립니다.
rat에서 casting을 한 후에 muscle atrophy를 일으켜운동을 시킨 후에 회복을 보는 실험을 계획 중입니다.혼자서 하는 실험이 처음이라 western을 하기 위한 sample을 만드는 과정에서protein extraction(cytosol)을 하려고 합니다. DNA나 RNA는 따로 분석을 하지 않기 때문에cytosol 수준에서 분석을 하기 위해 protein extraction에 몇가지 궁금한게 생겨 글 남깁니다.질문 1. protein extraction이 preparation과 같은 의미로 사용되나요??        preparation은 실험을 위한 사전 준비를 통걷는 말인가요??        같은 실험에 계신 분이 preparation은 잘되가냐고 물어보시길래 헷갈려서 그렇습니다.        (이 분이 extraction의 의미로 사용한 것은 확실합니다)질문 2. lysis buffer는 hepes buffer를 사용하려고 하는데 보고자 하는 단백질에 따라        사용하는 buffer가 다른가요?? 아니면 약간의 tip같은 것인가요??        사용되는 inhibitor가 다른 건지 궁금합니다.       (물론 비슷한 실험을 한 논문을 찾아보고 진행하겠으나 논문마다 방법이 다르더군요)질문 3. 관련 자료들을 찾아보면서 용어적인 부분에서 혼동이 많이 오는데          protein extraction과 homogenize, 그리고 preparation과 lysis buffer에 대한         구체적인 설명을 해주신다면 감사하겠습니다.질문 4. 혹시 제 실험과 관련해서 적절한 buffer나 protocol 혹은 tip이 있으면          조언 해주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 solK  |  2018.08.28
Q. Dialysis(solid AS or liquid AS)
안녕하세요 브릭 여러분.특정 단백질을 Ammonium sulfate로 침전 하는 중인데 궁금한 점이 있어 질문 드립니다.목적하는 단백질 외에 impurity를 제거 하기 위하여 AS를 10~80%까지 테스트를 하였는데이상할 정도로 target protein만 침전물 & 상등액 어디에도 존재하지 않고 있습니다.기존에 알고 있는 상식과 다른 점은, solid AS를 10~80%까지 treat 한 것이 아니라100% AS를 liquid로 만들어서 10~80%까지 처리하였습니다. 2번 테스트 하였는데 2번 모두 target protein만 사라지는 결과를 얻었고, 나머지 impurity는 상등액 또는 침전물에 모두 있는 것을 확인하였습니다.질문 요지는;1) solid AS와 liquid AS를 treat 하는 것이 차이점이 있는지?2) AS에 의하여 target protein만 사라지는 현상은 발생할 수 있는지? 궁금합니다.미리 답변 주신 분들께 감사 인사 드립니다.
회원작성글 sein  |  2018.08.27
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