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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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Q. qPCR 밴드 확인 첨부파일
qPCR primer를 디자인하고 qPCR 들어가기 전에  동일 조건으로 PCR 돌린 후 전기영동으로 band를 확인하여 비특이적 밴드가 안 뜨는지, 사이즈는 맞는지 등을 확인하려고 했습니다 primer는 size는 20mer이고 product size는 206, TM 값은 60정도이고 GC 비율은 F,R 각각 47, 55%였습니다. self complementarity나 self 3'은 제일 값이 낮은걸로 선택했엇습니다. PCR할 때 annealing temp.는 60도이고 40 cycle 돌렸었습니다. 사진 보시면 DNA를 넣은 lane에서 band가 나왔고 size는 잘 나온 것 같았습니다. 그런데 UPW를 넣은 lane에서도 희미하게 band가 나왔는데 문제는 이게 나올 때도 있고 안 나올 때도 있고 합니다. primer를 100pmol stock에서 20pmol로 희석해서 쓰는데 그때 컨탐 됐거나 혹은 실수로 DNA를 넣어줬거나 싶어서 다시 primer 희석해서 제대로 해보면 안 나오다가 다시 해보면 또 나오고... 계속 반복입니다 어디서 잘 못 된 것일까요?
회원작성글 YTB  |  02.25
Q. PCR 시 DW가 필수적으로 들어가야하는지?
raw sample에 inhibitor 가 많고, DNA 농도가 낮아   20ul 기준으로 DNA 5ul 정도 분주하고, BSA 4ul에 Primer 각 0.5ul 를 첨가하려고 합니다.   이후 cloning 이후 sequencing이 목적입니다.   DW 의 목적이 최종 volume을 맞추기 위함이라고 알고 있는데,   추가적으로 역할을 하는 것이 있는건지 궁금합니다.
회원작성글 김아무개석사과정  |  02.24
Q. dna 넣지 않았는데 pcr 후 전기영동 밴드가 뜰 수도 있나요..?
정말 말도 안되는 소리이지만... pcr 할 때, DNA 없는 것은 넣지 못하고 순서 맞추느라 Mastermix 는 넣었거든요.(mastermix는 17씩 넣었으며 10x primebuffer, dNTP, 프라이머, taq pol, D.W 입니다.)  무튼 이렇게 PCR 하고 로딩다이 넣은 후 전기영동 하는데 밴드가 떴습니다;; 아예 빈칸이어야 하는거 아닌가요??  제 생각에 가장 가능성 높은 것은 제가 커버를 잘 못씌워서 탶핑하거나 스핀다운 할 때 주변의 DNA가 섞여들어갔을 수도 있을 것 같은데...
회원작성글 윙깅  |  02.23
Q. multicomponent plot in real-time pcr 첨부파일
SYBR Green dye와 SensiFAST SYBR Lo-LOX Kit를 사용하여 real time pcr을 진행했는데 다른 커브나 플랏은 결과가 잘 나왔는데 multicomponent plot만 이런 식으로 증가했다가 감소하는 그래프가 나와서 어떤 식으로 해석해야할 지 도움이 필요합니다.
회원작성글 용용죽겠짛  |  02.22
Q. Provirus의 flanking region에 primer를 디자인했는데 대조군과 PCR product 크기가 같은 이유?
안녕하세요. 실험관련이 아닌 질문을 올려도 되는지 모르겠군요 ..  retrovirus 관련 논문을 읽는 중 궁금한점이 있어서 질문드립니다. 관심있는 특정 virus가 다른 virus에 integration되어 있는지 확인하기 위해 다양한 primer를 이용해 PCR을 수행한 결과가 있습니다.  당연히 provirus내부에 primer를 디자인하면 integration되어 있는 경우 band가 뜨고 대조군 host의 경우 band가 뜨지 않습니다. 그런데... provirus 외부 flanking region에 primer를 디자인하니 ... 대조군과 실험군의 band 사이즈가 똑같더군요 ...?? 당연히 provirus size만큼 product size의 크기가 증가해야 하는거 아닌가요 ..? 해당 논문을 자세히 읽어도 해당 현상에 대한 언급이 없어.. 제가 retrovirus에 대해 뭘 모르는건지 .. 결과 이해자체를 못한건지 ... 모르겠네요. 이러한 현상이 일어나는 이유가 뭘까요? 친구는 heterogeneity 때문이라고 하는데 / multiple band가 뜨는것도 아니고 .. 단일 virus 균주의 heterogeneity라는 것도 이해가 안됩니다. 실험관련 질문은 아니지만, 고견 부탁드립니다.  
회원작성글 멜롯  |  02.22
Q. multiplex pcr 진행했는데 밴드가 더블로 뜹니다. 첨부파일
사진에 M(male control)처럼 5개의 밴드가 뜨는게 올바른 결과인데 여러번 실험을 진행해도 밴드가 빨간원 처럼 2개로 뜹니다. 조금 더 전기영동을 해보니 아예 다른 밴드처럼 갈라집니다. 혹시 원인이 무엇일까요? EDTA whole blood에서 dna 추출 하였으며 상용 kit 여러개를 사용했는데 농도는 제각각 이지만 purity는 모두 1.8-1.9사이입니다.
회원작성글 초보실험자12  |  02.21
Q. single primer
cloning을 하려고 제한효소로 primer를 만들어 pcr을 해봤습니다. 사진은 왼쪽부터 marker, forward primer와 reverse primer를 넣었을때, forward primer만 넣었을때, reverse primer만 넣었을때 나온 band입니다. single primer만 넣었을때도 band가 나오는것으로 보아 ssDNA가 많이 생기는것 같은데 그럼 forward와 reverse primer를 모두 넣어서 pcr했을때에도 dsDNA가 아닌 ssDNA가 생겼을 경우도 높다는 것으로 봐도 될까요?  만약 그렇다면 pcr product를 정제해서 ligation하면 제대로 안될 확률이 높다는 걸까요? single primer는 증폭이 안되는 조건을 찾아서 pcr을 해봐야 되는지, 아니면 primer를 새로 제작해야하는지 궁금합니다. 
회원작성글 _유월  |  02.18
Q. targete gene의 snp 부분 포함한 pcr, rflp
제가 관심있는 유전자의 원하는 snp 부분과 관련하여 PCR-RFLP 분석을 하려고 합니다.  아직 공부를 시작한지 얼마되지 않아 관련 부분의 SNP부분을 포함한 서열의 다형성을 확인하기 위해 제한효소 선정이나 primer 제작 방법에 대해 잘 모릅니다. 제가 찾아본 바로는, OR6A2 gene의 rs72921001 부분에 snp가 있는데 이 부분의 앞뒤 20+염기를 포함한 서열에서 프라이머 서열 구성, 그리고 해당 자리의 제한효소는 그냥 실험자가 무작위로 정하면 되는걸까요? NEBcutter 에서 제가 snp를 포함하는 서열 앞뒤로 마음대로 선정해서 넣었는 데 이렇게 나오네요. 1) 유전자 서열중 내가 target하는 snp 포함하는 서열은 실험자가 중간에 어느 한곳부터 어느한곳까지 정할 수 있다(?) 2) 제한효소 찾는 사이트에서 해당 염기의 snp부분을 선택적으로 자르는 제한효소를 찾으려면 어떻게 해야하는지.. 질문이 광범위한데, 도움되는 말씀 아무 조언이나 부탁드려요 ㅠㅠ 첫가입하고 글썼습니다.  
회원작성글 해피나  |  02.17
Q. 2nd PCR 결과, Smear 하게 나오는 이유? 첨부파일
1st PCR 결과 band가 잘 나와서 별다른 Purification 단계를 거치지 않고, 동일한 primer와 PCR 조건을 가지고 2nd PCR을 수행했는데, 겔 홈부터 주욱 엄청 밝게 smear하게 나온 것을 확인하였습니다.. 1st pcr product는 1ng/ul로 희석하여 사용하였습니다. 95도 2분 95도 30초 60도 30초 72도 15초 72도 5분 40cycles. 이고 총 볼륨 20ul 중, template는 2ul 사용하였습니다.. 맨 오른쪽은 negative이며 primer에 어댑터를 붙여 길이가 긴것이 특징입니다. (primer dimer) 무엇이 문제일까요..?
회원작성글 김아무개석사과정  |  02.16
Q. primer 농도 계산
안녕하세요, 저는 real time pcr실험을 준비하는 대학생입니다. 제가 primer 농도 계산 하는게 헷갈려서 고수님들께 여쭈어보려고합니다. primer stock이 농도가 100pmol 이고 이걸 10pmol로 희석을 해서 사용을 하려고 하는데 PCR에들어가는 농도를 Forward & Reverse는 200nM으로 Probe는 100nM하고싶은데 계산을 어떻게 해야 할까요...? pcr최종 volume은 20ul입니다. 감사합니다.
회원작성글 초코맛꿀  |  02.16
Q. gel eletrophoresis에서 smeared가 약해진 후 뜨는 double bands 첨부파일
  어제 계속되는 smear 현상 후  조언해주신 대로 PCR cycle numbers를 40에서 30으로 줄이고 final extension time을 7:00에서 5:00으로 축소 시켰고,  primer도 원본 primer에서 다시 희석해서 사용했는 데    smear 현상은 약해졌는 데 double bands가 뜹니다.   PCR 조건을 한 번 더 바꾸어 주어야 하는 것일까요? 
회원작성글 sso_yeon95  |  02.15
Q. qPCR 질문있어요!
qPCR을 처음하게되어 질문드립니다.. 기초적인 질문이나.... 물어볼곳이 없어 질문드립니다. gDNA를 이용하여 qPCR을 진행하려하는데 보통 몇 ng정도의 농도를 실험에 이용하나요?? sample들의 농도를 나노드랍으로 확인해보니 50-300 ng/μL정도인데 어느 농도로 맞춰야하는지 감이 안잡히네요ㅠ 두번째 질문은 예를들어 무처리군, 약물 처리군이 있을때 각각 sample의 농도가 다릅니다. 이때 각각의 sample들의 농도를 동일하게 맞춘 후 실험을 진행해야하는것인지 아니면  GAPDH로 nomalization하기때문에 그냥 실험에 바로 사용해도되는것인지 궁금합니다. 도와주세요ㅠㅠ 감사합니다!  
회원작성글 djfudnjdy  |  02.14
Q. pcr premix와 primer가격이 얼마정도 하나요?
올해 고등학교 동아리 실험중 하나로 pcr을 계획중에 있어서, 동아리 예산을 편성중입니다. 찾아보니 bioneer에서 57000원에 팔고있던데 여기에 premix튜브가 몇 개 들어있는지, 혹은 다른 곳에서 구매할 때 premix 튜브 한 개당 얼마 정도 하는지 알고싶습니다. 또한 primer도 주문을 하려고 하는데 이것도 1회 실험 기준으로 얼마정도 하는지 궁금합니다
회원작성글 wnstj  |  02.14
Q. PCR product smearing 현상 첨부파일
  pcr product가 전체적으로 smear 현상이 너무 심하고 아예 증폭이 안되는 경우가 있어서 질문드립니다.. 약 120bp 크기의 band가 나와주어야 정상입니다. (사진에서 맨 아랫쪽 band) 원래 PCR 조건은, 95도 2분 95도 30초 60도 30초 72도 15초 72도 5분 입니다. 처음 8개 ladder는 anealing 온도를 2도 높혀준 것이고 그 뒤 8개 ladder는 3rd PCR을 수행한 것이며 (2nd PCR product를 1ng/ul로 희석) 그 뒤 8개 ladder는 raw 샘플로 1차 PCR을 수행한 것입니다. 1. 전기영동시 TAE buffer도 fresh 한 것으로 바꾸워주었고, 2. anealing 온도도 높여봤습니다. (60도 -> 62도) 3. negative에서는 아무것도 뜨지 않았습니다. 4. 새로운 template를 해서 PCR을 수행했을 때에는원래 증폭되던 샘플이었으나 이번 실험에선 아예 증폭되지 않았습니다. 샘플 특성상 inhibitor 가 많은 것이 특징입니다.. 계속 시도할 수록 결과값이 점점 더 안좋아지는 것 같습니다. 처음 몇번 실험할 때는 band가 어느정도 깔끔하게 나왔었는데..;; 혹시 DW가 문제일 수도 있을까요?  
회원작성글 김아무개석사과정  |  02.14
Q. 계속되는 Gel electrophoresis smearing 현상.
똑같은 method로 실험 중인데 1. 100㎖ 0.5X TAE buffer + 1g Agarose powder  2. 바닥 표면을 식힌 후 Et-br 2㎕를 넣음.  3. comb를 설치한 tray에 Agarose gel을 굳힘.  4. 70V 40min 동안 기다림. 그 후, 100bp ladder와 smaples gel에 4㎕씩 넣음.  negative smaple로 template을 넣지않은 D.W.도 PCR 증폭 후 gel electrophosis를 해보고 있는 데 contamination이 뜨지 않은 걸로 보아 Primer 문제는 아닌 듯 합니다.   그러나 어느 순간부터 smearing 현상이 지속됩니다.  gel을 굳히는 과정에서 일부 comb 구멍이 이상하게 생기는 경우가 있는 데 덜 굳히고 실험해서 이와 같은 현상이 일어날 수도 있나요?   
회원작성글 sso_yeon95  |  02.14
Q. AER ANA가 뭘까요...?
Aerobic anaerobic일까요... B=AER W=ANA로 적혀있습니다.. BD사 꺼에요
회원작성글 juiceju3  |  02.14
Q. 고층배지와 사면배지
고층배지는 배지를 세운 상태로 굳힌것이고, 사면배지는 배지를 45도 기울인 상태로 굳힌 것이잖아요?? 각도 차이일 뿐인데 왜 고층배지는 혐기성 균의 배양에 이용되고 사면배지는 호기성 미생물의 배양에 사용되나요??
회원작성글 juiceju3  |  02.14
Q. plasmid DNA copy number 계산 문의입니다~~
plasmid DNA를 계산한 후에 희석하여 standard curve를 그리려고 하는데요.   taget gene  :  123bp 이고  이 gene을 pGEM T-easy vector (3015bp)에 넣어서 plasmid DNA를 뽑은 상태입니다.   DNA copy number를 구하는 공식이 dsDNA일 경우 amount (ng) * 6.022* 10^23 / length (bp) *1*10^9*660 이걸로 알고있습니다. 여기서 amount (ng)에는 DNA 농도를 적는건 알겠는데 length (bp)에는 vector size인건가요? 아님 target gene size를 넣어서 계산해야되는 건가요.,.,?  이 부분에 대해서 정보를 찾고 있는데.. 잘 모르겠네요.. 도와주시면 감사하겠습니다!! 
회원작성글 soor  |  02.14
Q. qPCR 기계 램프교체 후 calibration이 필요할까요 ??
안녕하세요 ?  현재 Roche LC480 II 사용하고 있습니다. 최근에 램프쪽에서 문제가 있어서 램프랑 램프옆에 같이 돌아가는 팬들을 교체했습니다. 전원부도 문제가 있어서 교체했어요. 좀 오래되었거든요. 근데 수리 이후 실험을 진행했을 때 결과가 예전이랑 좀 달랐습니다.  (절대정량입니다) 이전에는 1.0e+08에서 Cp값이 15.8~16.3 정도 나왔었는데 수리 이후에는 거의 16.8~17.3으로 나오고 standard curve slope도 -3.3~-3.4에서 -3.5~-3.6으로 나오더라고요...   Roche에 문의 해봤는데, 대리점을 통해서 문의해서 차차 거쳐올라오게 하더라고요.. 일단 대리점에도 문의해봤는데 재현성이 있으면 다시 전화해달라고 해서 몇번 실험을 해도 결과가 동일합니다.   비슷한 경험후에 문제 해결해보신분 계시면 어떻게 해결하셨었는지 경험 공유 부탁드립니다..! 
회원작성글 Anchovy  |  02.13
Q. RT-PCR 시 RNA degradation 질문 드립니다.
안녕하세요 선생님들. RT-PCR 시 10n 10n-1 10n-2 10n-3 10n-4 10n-5 로 희석하여 triplicate로 PCR을 돌린다고 가정했을 때, 혹시 RNA degradation 문제로 triplicate 간과 농도 간 Ct값이 튈 가능성이 있을까요? 만약 그렇다면 혹시 선생님들께서 경험하시기로는 RNA sample을 몇회정도 freezing-thawing 하면 degradation의 영향을 받는다고 생각하시는지도 궁금합니다. BRIC에서 찾아보니 degradation과 contamination 등의 원인도 문제가 될 수 있다고 해서 질문을 드리게 되었습니다. 요즘 데이터가 자꾸 값이 튀어 고민이네요... 아래는 파이펫팅에 대해 주의해야 할 사항들이나 PCR 실험 시 주의해야할 사항들에 대해서 고찰한 내용들입니다. 1) 파이펫 팁 사용마다 교체 2) 피펫별 볼륨효율 고려하여 사용 3) 희석 시 동일한 파이펫 사용 4) 파이펫 팁 기포확인 5) 파이펫 in out시 속도 일정하게 조절 6) 손떨림 보정 7) 튜브 벽에 용액 흘려보내듯이 넣기 8) 탭핑 진행 후 1,2초 스핀다운 후 샘플 사용 8) 모든 샘플에 일관된 속도로 앨리콧 9) 파이펫 눈금 사용마다 변경되지 않았는지 확인 10) 동일한 각도로 파이펫 사용 11) oligo mix는 1step, RNA sample 2step으로 용액 넣기 12) 표면에서 용액따기 13) 뚜껑 닫을 때 내부 용액 튀지 않게 주의하기 PCR은 손을 정말 많이 타는 민감한 실험이라고 알고 있기에 제가 놓치고 있는 부분이 분명 있을거라 생각합니다. 요즘에는 파이펫 팁은 사용 후 버리지 않고 마지막에 관찰해서 혹시 내뱉지 않는 양이 있진 않을까 확인도 할 정도로 간절합니다... 위 사항 말고도 제가 놓치고 있는 부분이나 조언 또는 일침 주신다면 정말 감사하겠습니다.   
회원작성글 댕댕이러버  |  02.10
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