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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Laboratory Animals > Blood
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
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Q. Mouse PBMC분리(FACs샘플)
현재 mouse sample을 1ml정도 가지고 있는데 Ficoll을 이용하여 PBMC를 분리할 경우 cell count가 어느정도 나오는지 궁금하여 질문드립니다.. 혹시 혈액으로 FACs 분석할 때 SERUM, RBC lysis sample, PBMC 세가지 샘플을 준비할 수 있을 경우 어떤 경우의 분석이 적당한가요?
회원작성글 실험자..  |  2011.01.04
Q. Ficoll을 이용한 혈액 분리 문의
안녕하세요~ficoll을 이용하여 혈액분리 실험을 하여 PRP추출을 하려 합니다.혈액분리후 PRP층에 ficoll이 일부 포함되어 인체에 PRP시술을 하면 문제가 되는지요?ficoll은 GE의 제품입니다.
송창우  |  2010.11.10
Q. genomic DNA 추출에 관해서..
제가 환자 serum sample에서 DNA를 뽑아서 pcr.cloning을 해야하는데요..완전 초짜라 어려움이 많네요 ㅠㅠ;;pcr 밴드사진이 완전 다 끌려서 나오거든요..genomic dna만 추출한 후 전기영동을 거니 마커만 뜨고 아예 뜨지도 않는경우도 있고..농도측정 해보니 7.5ng.. 모 이정도 밖에 안나오던데..이정도면 dna 추출이 잘못된것인가요??human blood sample의 serum에서 dna 추출하셨던 경험있으신 분들계신다면..제가 sample 200ul을 갖고 QIAGEN kit를 갖고 추출하는데요..보통 dna가 어느정도 나오나요??도움좀 주세요.. 부탁드려요~~~!!!
냥~  |  2010.11.04
Q. T cell activation kit 관련 질문입니다.
PBMC를 사서 T cell activation kit 를 이용하여 T cell 을 activation 시킨후 실험에 이용하려고 하는데요혹시 miltenyi biotech 과 invitorgen dynabead 중 어떤것을 이용하는 것이 더 좋을까요?실험방법은 invitorgen 거가 더 간단하긴 한데..결과가 잘 나올수 있는 kit 좀 추천해주세요링크 연결해드릴께요한번 봐주세요http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11161D?ICID=search-producthttp://www.miltenyibiotec.com/en/PG_590_324_T_Cell_Activation_Expansion_Kit,_human.aspx
연구원  |  2010.11.03
Q. mouse PBMC culture..
마우스 PBMC로 실험을 하려고 합니다,,pbmc 분리 후 RPMI에 넣고 cck-8을 이용해 proliferation을 보려고 합니다,,처음에는 세포가 시간이 지날수록 급격히 줄어드는 것처럼 흡광도가 나왔습니다..그래서 알아보니 마우스 pbmc 배양시에 2-ME를 첨가해야한다고 해서,,50uM 농도로 2-ME첨가 한 후 배양을 시키는데..이제는 심지어 배지에 cck 만 넣은것과, 배지+세포+cck 넣은것의 흡광도가 차이가 없게 나오네요 ㅠㅠ배지도 새로만들어보고.. 세포수도 늘려보고 했는데..(10000개->20000개/well)문제가 무얼까요 ㅠ
회원작성글 질문 ㅠ  |  2010.11.02
Q. BM Transplantation Experiment
BM transplantation을 하고있는데, 실험이 원하는대로 되질 않아서 질문드립니다.여러분들의 귀중한 조언을 부탁드립니다.제가 보고자 하는 시스템은 WT T cells VS specific gene KO T cells 간의 일종의 competition입니다. 제가 쓴 프로토콜은 스탠다드 프로토콜로 1. BM cell isolation from WT and KO mouse (after Histopaque gradient).2. Inject BM cells (with different ratio, WT:KO = 1:0, 5:1, 1:1, 1:5, 0:1 ratio per each mouse, total 5 million cells per mouse) into 1200 rad irradiated recipient mice through tail vein.(WT BM donor cells from Boy/J mice, KO BM donor cells from C57BL/6 mice, and recipient mice are Boy/J mice)3. 4 weeks and 8 weeks later, check CD45.1 Vs CD45.2 with FACS.제가 원하는 것은 WT:KO = 1:1로 나오는 것입니다.그런데 KO BM cells만 인젝션한 쥐의 blood에서 8주후 FACS로 분석한 결과,CD3 negative cells은 99%가 CD45.2 positive가 나왔는데, CD3 positive T cells에서는 겨우 30% 정도만이 CD45.2 positive 가 나왔습니다.이 결과를 해석컨데 제 소견으로는 1. 1200 rad irradiation 이 충분하지 않아서 irradiation이 잘 안됨2. recipient mouse에 남아 있는 T cells이 방사능 저항성이 강해서 완전히 없어지는데까지 시간이 8주 이상걸림.3. KO BM cells 자체가 문제가 있어 T cells이 잘 자라나지 못함.이정도로 추측하고 있습니다.보통은 1100 rad만으로도 충분하다고 논문들에 나와있는데, 여러분들의 의견을 구하고 싶습니다.감사합니다.
BM lady  |  2010.10.30
Q. RNA prep from blood
샘플을 PAXgene tube에 받아오기로 했는데요 일반 blood prep을 할수 있는 킷을 그냥 사용해서 뽑으면 되나요??아니면 별도의 다른 프렙방법이 있나요?조언부탁드립니다.
rb  |  2010.10.08
Q. 도와 주세요
human blood를 갖고 COX, NOS, SOD, cytokinㄷ, HIF, FOS, JUN, Bcl-2, caspase, HSPs등을 분석하고자 합니다. 여건이 되지 않아서 외부 lab등에 맞겨서 결과를 알고 싶은데 이것들의 분석이 가능한 lab을 추천 해 주세요 감사합니다.^^
회원작성글 AUCK  |  2010.09.14
Q. RNA 추출
RNA 추출을 해서 일반 PCR로 cDNA 만든 후에 real time PCR을 통해 mRNA expression의 양상을 관찰 하려고 합니다. 질문: RNA는 혈액(whole blood)에서 추출 할건데요 얼마나 필요할까요?kit 마다 다르겠지만 일반적으로 얼마나 필요할까요?
회원작성글 버브  |  2010.09.13
Q. 면역관련 실험에 대한 질문입니다.
안녕하세요~ 석사 2학기 째인 학생입니다. 저희 실험실에서 주로하는 분야가 단백질 재설계 쪽인데요, 제가 본의 아니게 하게된일이 면역관련된 일입니다. 지도교수님도 이런쪽으로는 잘 모르시는지라 같이 공부하면서 일하고 있는데요b-cell culture에 관해서 궁금한 사항이 있어서 이렇게 질문드립니다. 제가 PBMC로부터 b-cell만 뽑은 후에 96well-plate 에 깔은 후에 baff라는 b-cell activator 를 쳐주고 다른 inhibitor를 함께 넣었을 때 그 시그널이 얼마나 줄어드는지 보고자 하거든요근데 궁금한것은 pbmc로부터 얻어지는 b-cell의 양이 너무 적어서 미리 pbmc 나 b-cell 에 baff를 넣어주고 b-cell의 개체수를 불린 후에 그 늘어난 b-cell 을 가지고 다시 위와 같은 실험을 진행하였을 때 동일한 결과가 나올 수 있을까요??저는 baff가 b-cell 증식및 분화에 작용을 하는 것으로 알려져 있어서 baff를 넣어줘서 컬쳐한 cell에 다시 baff를 넣고 키웠을 때는 cell의 성질이 달라져서 이렇게 하면 안될 꺼 같은데 교수님께서 될 것 같다고 한번 알아보라 하시네요.구글링하다가 도저히 답을 못찾겠어서 이렇게 고수님들의 의견을 묻고자 합니다. ㅠ 도와주세요
석사초보  |  2010.09.03
Q. PBMC 와 cell count 에 대한 질문입니다.
저희 실험실에서 EDTA whole blood에서 PBMC를 분리하여 동결보관하는데요..PBMC는 manual로 분리하고 있습니다. 전혈을 원심분리한 뒤 buffy coat를 따서 RBC lysis buffer (저희는 ammonium chloride를 사용하고 있습니다.)로 RBC를 lysis 시킨 뒤, washing 하고 마지막에 PBS를 넣습니다. 이상태로 -70도에 동결보관하고 있습니다. 얼마전 교수님께서 이렇게 보관하던 PBMC로 실험하시겠다고(아마 FISH나 squencing을 하시려던것 같습니다.) sample을 가져가셨는데 며칠뒤에 cell 이 다 깨져서 하나도 안보인다고...direct로 하면 완전 clumping 심하고.. dilution하면 하나도 안보이고...웬만하면 조금은 cell 이 보이는데 완전히 안보인다고 하셨습니다..ㅠㅠ제가 여기저기 알아보니 PBMC를 분리하는 과정에서 쓰는   RBC lysis buffer 나 PBS가 세포에 stress가 되어 cell 이 잘 죽고, PBMC는 해동과정에서 clumping이 잘되어 해동시에 온도나 시간도 잘 맞춰야 하고 DNase를 비롯한 여러 reagent를 첨가하고 centrifugation과정도 거쳐야 하는 등 주의를 기울여야 한다고 들었는데 무엇이 문제일까요??저희는 sampling 할 때 다른 첨가물이나 부수적인 과정없이 그냥 단순하게 PBMC를 분리해서 얼리는데 DNA extraction 할 때는 문제가 없어보이는데 DNA 분리에는 사용할 수 있을까요??선배님들의 도움 부탁드립니다.ㅠㅠ
회원작성글 cjswo  |  2010.09.02
Q. Ficoll을 사용한 loading buffer가 이상합니다.
Native RNA gel을 하기 위해서 검색한 후15% Ficoll, 0.25% Bromophenol blue, 0.25% Xylene cyanol 로 구성된 10X loading buffer를 만들었습니다.그런데 RNA와 1:9로 섞은 후 TBE agarose gel에 loading을 하니 sample이 가라앉질 않고 떠올라 버립니다.왜 그럴까요?
회원작성글 너무많은Clonin..  |  2010.08.27
Q. FACS용 혈액샘플 저장법
제가 실험하려는 것이 임상환자의 혈액을 모아 FACS를 찍어 B-cell, T-cell, NK-cell을 확인하려고 하는것입니다. BD사의kit를 사용하여 실험을 하려고 하는데 프로토콜상에는 혈액을 채취하여 바로 실험하라고 되어있더라구요..임상환자의 실험이고 실험을 하기 위하여 다른 연구소로 직접 가서 실험을 해야 하므로 그때마다 할수 없는 실정입니다. 1. FACS용 혈액샘플을 저장하는 방법을 알고 싶습니다. 찾아본 자료에는 전혈을 PBS로 wash을 하여 PBS, 1%BSA, 10% DMSO로 -70도로 저장하라고 되어 있는데 이 방법이 맞는것입니까?2. 한번도 FACS를 해본적이 없습니다. B-cell, T-cell, NK-cell의 정도를 파악하기 위하여 전혈을 사용하는것이 적당한지요. 아님 peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)을 사용하는 것이 더 나을까요?3. kit를 사용하는것이 더 저렴할까요? 아님 각자의 시약을 사서 하는것이 더 저렴할까요?
초보연구원  |  2010.08.10
Q. Human PBMCs 관련 질문입니다.
안녕하세요 human PBMCs를 연구하는 중에 어려움이 있어 문의드립니다.현재 PBMCs를 얻은 후 바로 ICS해서 분석하는 연구를 진행중인데요ICS가 자극시간도 있고 Ab 붙이는 시간도 있어서 시간이 오래걸리는 어려움이 있습니다.그래서 할수없이 human PBMCs를 얼려두었다가(질소탱크)진행해보았는데 그렇게 해보니 viable cells은 다행히 크게 줄지는 않았지만자극 후 cytokine 분비가 많이 약해진 모습을 보이더군요..;;혹시 human PBMCs freezing이나 thawing을 다르게 하면 조금 개선할 수 있을까요?저는 PBMCs 분리 후 washing하고 freezing media (90% FBS, 10% DMSO)에 풀어서-70도 deep freezer에 넣었다가 하루 뒤에 질소탱크로 옮기는 식으로 freezing했고thawing은 vial을 꺼내고 최대한 빨리 녹여서 media에 바로 풀고 washing한 후에실험을 진행하였습니다.가능성이 높진 않을 것 같지만 혹시라도 이 곳에서 도움이 되는 조언을 얻을 수 있을까해서 글 남기니 많은 고수님들의 답변 부탁드립니다.
밤샘연구  |  2010.08.06
Q. Atopy dermatitis 를 유발시킨 마우스에서 mRNA Level IL-4 확인방법 부탁드립니다.
안녕하세요!! 이제 실험을 시작하게되는 석사준비하고있는 학부생 입니다. 다름이 아니옵고, 제가 아토피 모델 마우스를 가지고 아토피를 유발시킨 다음에 Atopy 검증을 위한 실험을 준비 해야합니다.Protein level에서는 혈액을 채취하여 plasma를 분리하여 IG E를 체크하는 kit 가 있습니다.하지만 mRNA Level에서 IL-4 나 IFN-r 를 측정하고 싶습니다. 어떤 논문에서는 PBMC를 분리하여 3~12시간 culture 한다음 RNA를 추출하여 확인하는 방법이 있는데,, 혈액의 너무 적어 힘들꺼라 생각됩니다. 피부조직을 갈아서 RNA를 추출할때에는 RNA가 쉽게 깨진다고 합니다..Atopy를 유발시킨 마우스에서 lymphnode를 채취하여 RNA를 추출하여 IL-4를 확인한다는 내용도 보았습니다. cytokine들이 secretion 되지않고 lymphnode에 남아 있을수 있나요??고수님들 제발 부탁드립니다. 좋은 방법을 알려주세요!!  이밖에 더 좋은방법이 있다면 알려 주세요!!
회원작성글 루비아이  |  2010.08.03
Q. 슈반세포, Schwann cell에 대해서..도와주세요!!!
신경세포는 한번도 해본 적이 없는 완전 초짜입니다ㅠSchwann cell을 blood에서 isolation할 수 있다는 method를 본 것 같은데,잘 모르겠더라구요...보통 쥐에서 얻는 것 같은데, 사람에게서 얻는 방법이 있나요?쥐에서 얻는다면 어떻게 얻으면 좋을지 좀 도와주세요ㅠmethod를 찾아보면 나오기는 하는데....해보신 분들이 좀더 상세히 알려주시면...저에게 빛을 주시는 거랍니다!!! 부탁드려요ㅠ
회원작성글 T  |  2010.08.03
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