[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
엘앤씨바이오
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
전체보기 안전점검 LABox
 카테고리: 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
카테고리 전체보기펼치기
질문/투표/프로토콜 등록
Q. Lysis buffer에서 ME?
제가 연구하고 있는 단백질 X는 lipid raft에만 존재하는데 lysis buffer를 어떻게 만들어야 하나로 골치를 앓고 있습니다. 1) 먼저 whole cell lysate에서 gradient centrifugation으로 raft fraction만 따로 분리해서 이를 Sample buffer로 녹인 후 WB을 해봐야 하고 2) Whole cell lystae를 가지고 anti-X로 IP를 한 후, X와 binding하는 Protein Y를 확인해야 하는데 문제는 1) & 2) 모두 다 안되고 있습니다.TT RIPA buffer로 whole cell lysate를 만든 후 anti-X로 WB을 하면 잘 나오는데 1) Triton X-100으로 녹여서 gradient centrifugation 해보면 tube에 육안적으로 raft fraction은 잘 보이는데 이를 sample buffer에 녹여서 anti-X로 WB을 해보면 아무 것도 안 나옵니다. 2) anti-X로 IP를 한 후 anti-X(monoclonal)로 재확인해 보면 분명 밴드가 잘 보이는데 anti-Y로는 아무것도 안 보입니다 (이 결합은 워낙 잘 알려진 것입니다) 그래서 Lysis buffer의 적정성에 의문을 품게 되었는데 문제는 저널을 찾아보니 lysis buffer recipe가 수십 개는 되는 것 같습니다. 말이 너무 길어졌지만 그 중 몇 그룹은 lysis buffer에 5mM B-Mercaptoethanol을 썼던데, B-ME를 sample buffer가 아니라 lysis 단계에서 바로 쓰는 경우도 있나요? 그리고 IP 전에 cell lysis 단계에서 B-ME가 들어가 있어도 protein interaction에는 별다른 영향이 없을까요? 고수님들의 도움 부탁드립니다.
질문자  |  2009.01.25
Q. IP 결과 밴드 이해불가
아무리 생각해도 이해가 안되서 고수님들의 의견을 구합니다. 저는 최근에 flag-fusion construct를 transiently transfection 시켜서 Flag-M2 Affinity gel (sigma, monoclonal mouse antibody covalently attached to agarose)이용해서 IP를 했습니다. flag-fusion protein 의 사이즈가 약 23~25 kda 인데, whole cell lysate를 Flag-M2 affinity gel(줄여서 A라고 하죠)과 over night 인큐베이션 한 후, 세차례 와싱을 하고 (with lysis buffer) IgG contamination을 피하기 위해 sigma 가 권장하는 대로 sample buffer에 beta-mercaptoethanol 이나 DTT를 사용하지 않았습니다. sample buffer 를 넣고 4분간 끓여서 젤에 로딩하고 결과를 보았습니다. 결과적으로 precipitation은 된것 같습니다. 어느정도 light chain contamination이 된것 같은데 (Negative control A만 넣고 cell lysate는 넣지 않았습니다. 시그마 권장사항) 약간의 사이즈나 양의 차이도 있고 해서 target protein 이 맞는것 같습니다. 그런데 문제는 target protein 과 인터액션한다고 알려진 다른 단백질(B라고 하겠습니다. 약 80 kda)을 확인해보려고 했을때에, 이상하게 예상보다 좀 적은 (약 5에서 많게는 10 Kda 정도?) 사이즈에서 밴드가 나옵니다. 그리고 그냥 whole cell lysate를 옆 lane에 Positive control로 걸었을때 작은 차이지만 확연하게 사이즈가 구별됩니다. 처음 필름을 봤을때 헤비 체인이라고 생각했었는데, 다시 보니까 일단 사이즈도 헤비체인보다 크고 (around 70 kda 정도로 보임), 무엇보다 negative control 에서는 이밴드가 전혀 보이지 않습니다. 만약 헤비체인이 아니라면 B 단백질이 아닐텐데, 그래도 whole cell lysate 와는 사이즈가 다릅니다. 제가 묻고 싶은것은 혹시 ip 과정중에서 단백질의 크기에 영향을 주는 일이 생길 수가 있을까요? 아래는 제가 사용한 버퍼들의 조성입니다. Lysis buffer : 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 mM Sodium orthovanadate, Protease inhibitor cocktail, and 1 mM PMSF (여기서 Sodium orthovanadate 은 phosphatase 를 inhibition 하기위한 목적으로 넣었습니다.) Sample buffer :125 mM Tris HCl, pH 6.8, 4 % SDS, 20 % glycerol, 0.008 % bromphenol blue 약간 좀 의심스러운건 cell lysate와 antibody를 over-night incubation 하고 spin down 해보니 agrose bead 가 약간 yellow 로 색이 좀 변해있었습니다. 혹시 제가 lysis buffer에 sodium orthovanadate 을 넣은게 단백질 크기에 영향을 주었을까요? whole cell lysate도 같은 조성의 버퍼를 쓰긴했지만, 그건 protein을 isolation 한후 sample buffer를 넣고 얼린후 그다음날 같이 끓이고 로딩한거라서 완전히 같은 조건이라고는 할 수 없을듯 하기도 하구요. 좀 길어서 죄송하네요. 도와주세요 !
extrafine  |  2009.01.18
Q. AU/ml 이 무슨말이죠?
논문에 나와있는 ChIP protocol중에 "OD260 was adjusted to 6 AU/ml in IP buffer." 라고 쓰여있거든요. sonication하고, centrifugarion하고, 상층액 새 튜브로 옮기고 저렇게 하라네요.. 양을 맞추는거같은데.. AU/ml 단위를 어떻게 생각해야하는건지 모르겠습니다. ㅠㅠ
회원작성글 chip  |  2009.01.08
Q. Detergent 에 관한 상식적인 궁금증 여쭤봅니다..
여태까지 수많은 detergent 를 써왔지만, 각각의 물성을 잘 모르겠습니다. Triton X-100, NP-40 를 예로 들면, 둘중 쉽게 표현해서 더 harsh한 detergent가 무엇인지요..? 그리고 NP-40의 경우 저희 랩에서는 예전에 A사의 제품을 오랫동안 써왔었는데, 다 쓰고 새로 구입하려 보니, NP-40 substitute 라고 동일한 제품번호로 판매하더군요. 근데, 이게 예전의 NP-40와 완전히 동일한 물성의 제품인지를 알 수 가 없고, 제조사에서도 알려주지를 않더군요. 예전 NP-40 based IP 버퍼로 쎌을 lysis 시킬 때 보이지 않던 것이, 최근 새로 바뀐 NP-40 buffer로 lysis 시킨후 clarify 하고 나면 센트리퓨즈 직후 상등액 상층에 허옇게~ 뭔가 구름같은 것이 뜨더군요.. 이게 뭔가 싶기도 하고.. Triton X-100으로 대체 해도 되는 것인지 모르겠네요.. 실험실에서 항상 사용하는 detergent에 대해서 자세한 물성도 모르고 쓰고 있는 것 같아서 답답한 마음에 질문 올립니다...
대학원생  |  2008.12.30
Q. IP(immunoprecipitation)에 관한 기초적인 궁금증이 있습니다.
갖 박사학위를 받은 학생입니다.. 그동안 수없이 많이 IP를 했지만, 아직도 풀리지 않는 궁금증이 있어서 질문드립니다. IP 결과가, 세포를 lysis 하기 이전에 intact한 세포 안에서 서로 붙어있는 protein complex의 결합을 반영하는 것인지, 아니면 lysis 이후 tube 상에서 서로 결합 가능성이 있는 protein들 간의 재결합(reconstitution)을 반영하는 것인지 궁금합니다.. 예를 들면 A와 B가 서로 결합하고 있다고 할 때 lysis 과정에서 A 와 B 는 계속 붙어 있고 A로 IP 했을때 B 가 나오는 것인지.. 아니면 lysis이후 A 와 B 가 원래(본질적으로) 결합 하고 있던 단백질이라면 tube 상에서 서로 다시 만나서 IP 결과로 반영되는 것인지... 아직도 궁금합니다..어떤 것이 사실에 가까운 것일까요..?
대학원생  |  2008.12.30
Q. nuclear extract co-IP
검색을 해보았는데, 딱히 답이 없어 질문 드립니다. 핵과 세포질 단백질을 얻어, IP를 수행하려합니다. nuclear extraction kit를 사용하여 얻은 단백질들에 buffer를 넣어, IP를 수행해도, interaction에 영향이 없는지요? 이때 사용하는 버퍼는 DW or PBS or mild lysis buffer (low salt) 어떤 것이 괜찮을까요? 분명 nuclear extration buffer는 high salt일텐데, 네이쳐 논문에 이를 맞춰주는 buffer를 넣어 equilibration 시키면, (각각을 같은 조건에서 IP 수행할때 buffer condition(salt conc.)를 맞춰줘야 하나요?), final NaCl 농도가 세포질은 142mM, 핵은 210mM 입니다.
IP  |  2008.12.17
Q. ChIP assay 애물단지네요 ㅠㅠ
input조차도 안나와서 무진장 애를 먹고있습니다. sonication조건이 중요하다고들 하셔서 저희방에 있는 sonicator를 사용한 protocol을 참고로 오늘 해봤습니다. size를 먼저 확인하고나서 진행하려고 소니케이션 후 50ul정도 따서 revers-crosslinking ~ PCR purification kit로 DNA purify 한 후에 agarose gel에 걸어봤습니다. 그런데 아무것도 없는거에요 ㅠㅠ 제가 사용한 protocol인데, 한번 봐주시길 부탁드립니다. 1. cells were washed 2. cross-linked with 1.1% formaldehyde at room temperature for 10 min 3. the reaction quenched by addition of glycine to a final concentration of 0.125 M. 4. Cells were harvested, lysed in 10 mM Tris HCl pH 8.0, containing 10 mM EDTA , 0.5 mM EGTA and 0.25% Triton X-100 solution for 30 min at 4°C 5. centrifuged at 200g for 5 min 6. the nuclear pellet washed in 10 mM Tris-HCl pH 8.0 containing 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA and 200 mM NaCl 7. nuclei were resuspended in sonication buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1% SDS w/v, 1 mM AEBSF, 10 μg/ml aprotinin, and 0.8 μg/ml leupeptin) 8. After centrifugation, the OD260 was adjusted to 6 AU/ml in IP buffer (NaCl 140mM, Triton X-100 1% wt/vol, DOC 0.1% wt/vol, PMSF 1 mM, yeast tRNA 100 mg/ml, BSA 100 mg/ml) 9. precleared for 15 min at 4°C with Staph A cells. 10. incubation with antibodies가 붙은 bead로 O/N 11. bead wash with RIPA 5번 12. antibody/protein/DNA complexes were eluted with 50 mM NaHCO3, 1% (w/v) SDS, and treated with RNase A. 13. Samples were incubated at 67°C for 4-5 hrs 14. The DNA was purified using the QIAGEN PCR Purification kit (Qiagen Inc.,Valencia, CA, USA), stored in 50 μl of 10 mM Tris-HCl pH 8.5, and 2 μl was used for PCR.
회원작성글 chip  |  2008.12.15
Q. IP시 단백질 양...
안녕하세요.. 이번에 프라이머리 셀를 이용해서 immunoprecipitation를 하게 되었는데요 프로토콜을 찾아보니 필요한 프로테인 양이 1mg 혹은 1ml은 되어야 한다고 해서 좌절 중입니다.. 세포 특성상 1mg, 1ml나오는게 무척 어렵거든요.. 최저 사용가능한 프로테인 양은 어느정도 부터 가능할까요? 혹시 적은 양으로도 가능한 킷 같은거라도 있을까요?
@@  |  2008.12.06
Q. i.p. 또는 i.v.에서 EtOH 또는 MeOH 사용가능?
안녕하세요. i.p. 또는 i.v.에 쓰는 drug가 물에만 잘 안녹아서 DMSO 5%와 함께 녹여서 실험했는데 DMSO가 brain tissue에 영향을 끼친다는 보고가 있어서 부득이하게 DMSO이외에 MeOH 또는 EtOH를 쓸려고 합니다. 물론 최소 용량으로 쓸 계획인데, ip 또는 iv에서 MeOH 또는 EtOH을 쓴 논문이나 예를 못찾겠네요. MeOH, EtOH 둘중에 어느게 in vivo에서 덜 toxic한지요? 혹시 MeOH, EtOH을 단순 용매로 in vivo에서 써보신 분 있으신가요?
회원작성글 jkim  |  2008.12.03
Q. IP할때 antibody dilution이요~
저 IP 완전 초짠데~~ IP할때 antibody technical sheet에는 1:100으로 하라고 하는데~ 어디에대한 dilution인가요?? 총 volum 을 buffer로 1ml로 맞추고, IP를 한다면~ antibody를 10ul나 넣어야 한다는 것 같은데... antibody가 그렇게나 많이 들어요? 돈이 엄청날텐데...
ㅠ-ㅠ 졸업원츄  |  2008.12.02
Q. lysis 버퍼에 glycerol 농도
여기 게시판을 보다가 glycerol 을 ip buffer에 넣는다는 걸 보았네요.. 넣는다면 몇 프로로 보통 사용하나요.. 그리고 정량에는 문제가 없는지요? 제가 셀을 하베스트한 후 lysis 버퍼로 갠다음에 열흘 쯤 후에 봐야하는 상황인데요, 이럴 경우 glycerol을 넣는 것이 도움이 될런지요..?
ip  |  2008.11.13
Q. IP 관련 질문 답변해주신분들 다시한번 봐주세요
제가 처음으로 IP를 set up 해서 실험을 하고 있습니다. 1. cell 을 harvest해서 lysis 할때 buffer을 다음과 같은 조성의 버퍼를 사용했습니다. 100 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% BSA 각각 조성의 역활과 이것을 사용했을 시에 문제점은 없을까요? 2. 위의 lysis buffer로 IP 각 단계의 washing에 사용했습니다. 3. non specific band가 걱정되어 triton x-100을 cell 과 prymary antibody 반응시에 넣어주려고 합니다. 이렇게 해도 될까요?
IP  |  2008.11.11
Q. Chromatin immunoprecipitation assay 첨부파일
논문공부 처음으로 하는 석사생입니다..ㅠㅠ 공부하다가 너무나 생소한 실험들이 많아 질문을 하는데요.. Chromatin immunoprecipitation assa 의 원리라든지.. 이 그림에서 input DNA가 어떤 말인지.. 혹, positive control? 그럼 여기서 control은 negative? 바쁘시지만 아시는 분들 살짝 알려주세요^^
공부중에..  |  2008.11.07
Q. kinase assay가 되지 않을 때..바꿀 수 있는 조건들..
GST-fusion protein을 substrate로 하여 kinase assay를 하고 있습니다. kinase는 293T cell에서 expression한 후 ip한 bead를 사용하구요. 전임자가 한 데이타가 있는데 깨끗하게 잘 되었더군요 그러나 positive control이 없어서 알려진 positive control과 함께 saay를 하는데control은 triton을 넣어도 잘 되는데, substrate는 되지 않습니다. reduced GSH를 많이 넣어주면 ph가 변해서 그것도 걱정이고, 30ul reaction에서 대체 ph를 어케 마추라는 건지... paper에 묻혀도 다 없어질텐데 말이죠. bead로도 했지만 흔적조차 없습니다. 지금은 substrate도 mammalian cell 에서 expression하고 ip 하여 해보려고 준비중인데요, 에고...참 답답하네요. 전임자 데이타가 잇으니 뭐라도 되어야 할텐데, 조건이 딱히 다르지도 않습니다. 이럴 경우 제가 조건을 바꾼다면 무엇이 있을까요? 원체 이 kinase는 렙에서 흔하게 assay를 하는 거라서 조건이 완전히 잡혀있는 상태입니다.제것에서 달라질 수도 있겠지요만, 솔직히 전임자 데이타가 이상할 따름입니다.. 어떤 시도를 해봐야할까요?
에효  |  2008.11.05
Q. in vitro kinase assay 첨부파일
처음으로 kinase assay라는 것을 해봅니다.. 방사선을 쓸 수 없는 관계로 phospho Ab를 이용하려구요.. 그림을 같이 올립니다..너무나 부끄럽지만 논문을 빨리 내야 하기에...ㅠ.ㅠ kinase는 cell에서 IP하였습니다... 그리고 substrate는 cell signaling에서 샀구요.. 제가 잘 모르는 관계로 제가 했던 스텝을 적어보겠습니다..많은 조언 부탁드릴께요.ㅜ.ㅜ control, chemical, IgG, positive control 이렇게 구성되어 있구요... --> cell에서 1mg의 단백질을 protein-G bead로 IP (O/N, 4도씨) --> lysis buffer와 kinase reaction buffer(DTT:add, ATP:no-add)로 washing --> bead와 같이 있는 kinase에 substrate(3ug) 넣고 25도씨 30분 반응 이때 vortex에 꽂아서 윙윙 섞이게 한 채로 반응(^^;;) --> 그리고 30분 뒤에 SDS-sample buffer넣고 5분간 끓임.... --> 모든 볼륨을 젤에 걸어서 IB하였음.... IB는 phospho-Ab로 detection 하였음.... 그랬더니 이렇게 새까맣게 나오다 못해 구멍까지 뚫리네요..시그널이 넘 강한가봐요ㅠ.ㅠ 제가 어떻게 무엇을 고쳐야 할지 잘 모르겠어요... 한번 보시고 조언좀 해주세요..
초보  |  2008.10.13
Q. immunoprecipitation
immunoprecipitation 후, kinase assay를 하려고 합니다. 한 번 해보았는데, 가장 큰 문제점은 bead가 자꾸 같이 딸려올라와서 washing 시 줄어드는 것 같아요. 여기엔 kinase가 있기 때문에 손실되면 안될텐데요. 1. 어떻게 이 문제를 해결나시나요? 2. 60mm petridish에 어느정도의 protein A와 항체를 넣으면 적당할까요? immunoprecipitation에 경험이 많으신 선생님들의 조언 부탁드립니다.
멍옹이  |  2008.10.03
이전  11 12 13 14 15 16 17  다음
실험 회원 등급이란?
실험Q&A 회원등급안내
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
한국폴 광고