안녕하세요 이제 막 입학한 초보 석사입니다.   이번에 ELISA을 통해 HaCaT cell에 drug 처리를 하여 나온 IL-1β, IL-6의 생성량을 보려고 합니다. 하지만 결과는 Standard는 R^2 0.997정도로 잘 나오는 반면 Sample은 Blank와 인접한 결과를 나와서 고민입니다.   Sample assay는 seeding -> starvation 24H -> Treat -> Harvest(media 상등액을 12,400rpm 10min 처리 후 다시 상등액을 -20도에서 보관) 입니다.   ELISA assay는 kit 제조사인 R&D system의 지침대로 진행하였습니다.   ELISA 중 standard와 sample을 96well plate에 넣을 때, Harvest한 media을 원액 그대로 넣어주었는데요.   Bric에서 검색하였을 때, 대부분 Media을 적절한 희석액에 희석 후 사용하셨던데, 희석하지 않고 그냥 사용시 media의 성분에 의해 간섭이 생길수있다는 글을 봤습니다.   혹시 media을 희석하지 않아 ELISA 결과에 문제가 생긴것인지 여쭙고 싶습니다.     아 참고로 media는 DMEM을 사용하였습니다.

direct elisa와 indirect elisa 의 차이점 그리고 indirect elisa의 장점이 뭐가요???  indirect elisa 가 검출하는게 더 증폭된다고는 알고있는데 왜 더 증폭되는지 궁금합니다 좀 자세히 알려주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠ 

저는 mouse에 s.c로 injection한 LLC tumor 조직을 gentleMACS로 dissociation 후 그 안에 존재하는 면역세포들을 분석하고 있습니다.  그런데 flow cytometry시 tumor cell에 의해 aquisition 시간이 너무 오래 걸려 leukocytes를 enrichment 시키기 위해 density gradient centrifuge를 진행하고자 하였습니다.  제가 찾아본 protocol 상에서는 Cytiva 사의 percoll 제품을 기준으로  40%-80%, 30%-70%, 44%-67% 등의 조건으로 낮은 농도의 solution에 cell을 re-suspension 후 overlay 하여 centrifuge를 돌리는 것으로 나타나 있는데 실제로 진행해보면 분리가 잘 되지 않아 경험자의 조언을 듣고자 합니다.  지금까지 해본 조건으로는 위 언급한 %의 percoll을 이용하여  1. 325g acc. 5 brake. 5 25min, RT 2. 600g acc. 0 brake. 0 30min, RT 3. 800g acc. 0 brake. 0 30min, RT  로 진행하였는데 모든 cell이 interphase에 모여버리거나 거의 대부분 pellet으로 down 되어 버리는 현상만이 관측되고 있습니다.  해당 tumor cell로 density gradient centrifuge 실험을 해보신 분이 계시다면 tip을 알려주시면 감사하겠습니다. 

제목 그대로 kit 측정시 사람들마다 다른 값이 나옵니다....ㅠㅠ   스텐다드는 항상 나오는데 어떤 사람이 측정하면 -값으로 나오는데 다른사람이 측정하면 +로 검출되거나 N, C 군이 차이가 나지 않았는데 다른사람이 측정하면 차이가 나거나   솔직히 kit protocol이 어려운게 아니고 하라는대로만 하면되는데... 그리고 실험실 온도는 거의 일정하게 유지가 되고있습니다ㅠㅠ 인큐베이터에 넣어 동일한 온도로 반응시켜도 사람마다 차이가 너무 심하게 나는데 어떠한 문제가 가장 클까요 ㅠㅠ? 워시할때 버퍼가 남아있을 가능성도 거의 없습니다 ㅠㅠ

안녕하세요 IP 실험을 training 중인 학생입니다. Training 중이라서 간단하게 Syk protein에 대해 IP를 진행하고 IB로 p-Tyr과 Syk를 detection하려고 하는데요... p-Tyr과 Syk조차도 detection이 안되고 있어요... 다른 과정에서 문제가 있을 수도 있겠지만 IB를 진행하면서 1st Ab 사용시 WB만을 진행할 때와는 다른 주의해야할 사항이 있을까요...?

안녕하세요 ELISA를 처음 해보는데 값 계산 관련하여 질문드립니다.  protocol 대로 하고(3반복) 450nm에서 측정한 후 standard surve를 그려 흡광도를 대입하여 target sample의 농도를 구했습니다. 문제는 1개의 sample 당 흡광도 값의 차이가 너무 큽니다. 1. wash 할때 멀티 파이펫으로 200ul/well 해서 하는데 이것 때문일까요? 2. 논문에서 보여주는 농도 값은 3반복의 각 농도 값을 평균 낸 값인건가요?  3. 3반복의 값 중 2개의 값이 비슷하다면 2개의 값만으로 평균을 내도 되나요? 4. Versa max spectrophometer 를 사용 중인데 elisa-endpoint / elisa-kinetic 중에 endpoint를 사용하는게 맞나요?      

elisa를 시작한지 얼마 안된 사람입니다.... elisa 하고 o.d값을 보면 standard의 4 point 정도의 well만 capture antibody가 well 바깥쪽에만 집중적으로 붙어있어요,....... well에 capture antibody 주입할 때 tapping이랑 vortexing이랑 spin down 잠깐 해서 충분히 골고루 주입했다고 생각하는데 왜 이러는건지 정말 모르겠어요ㅜ well에 주입할때 well 벽면에 팁 끝을 조금 붙여서 바깥쪽으로 흐르게 주입해서 그런걸까요... well에 주입 후 plate tapping이 덜 되어서 그런건지 정말 감이 안잡힙니다. elisa 고수님덜 도와주세용ㅠㅠ

안녕하세요   Human cell로 western blot 실험을 하려고 항체를 찾고있습니다. 궁금한 점이. human cell이면  항체 정보를 보게 되면 species에는 human 이 포함된 것으로 하고  host species는 rabbit 이나 mouse 로 된 항체를 구매하면 되나요?   답변 주시면 감사하겠습니다.

증류수를 하루에 1000~ 1500L정도 사용할 예정인데요    이런경우는 그냥 증류수 구입하는게 나을까요??  아니면 장비를 구입해서 제조사용을 하는게 나을까요?

안녕하세요 PBMC 사용한 실험을 해야하는데 직접 피에서 추출 하지 않고 미리 추출 된 PBMC를 파는 회사 없나요?  알고 계신 것 있으면 추천 좀 부탁 드립니다...

안녕하세요 western blot과 immunohistochemistry에 관해 자료 조사하다 궁금한 점이 생겨 여쭙니다 제가 조사한 바로는 둘 다 단백질 검출에 쓰이며 주로 항원항체 반응을 이용하는 것 같더라구요 이 두 방법은 자주 비교되는 방법들인가요? 이를테면 이런 경우엔 western blot이, 다른 경우엔 immunohistochemistry가.. 이런 식으로요.  또 수업에서 model은 traumatic brain을 가진 동물을 이용하셨는데.. 특별한 이유가 있어서인지도 알고 싶습니다.  

PBMC를 가지고 FACS 를 찍고 lymphocyte를 게이팅 해야되는데  일반적인  PBMC facs population과 달라서 어떤게 lymphocyte 의문입니다.  일반적인 pbmc  population  제가 찍은 PMBC population 1번과 2번중에 어떤게 lymphocyte 인가요? 혹시 1번은  debris인가요?? 아님 1번과 2번을 다 같이 잡아야 할까요? 왜 population이 저렇게 나오는 걸까요? FACS 고수님들 알려주세요 ㅠㅠ  

SARS-CoV-2(코로나 바이러스) 가 우리 몸 숙주인 ACE2 수용체와 결합될 때, 몸에서 열이 나는 이유가 시토카인(이터류킨, 인터페론) 때문이 맞나요? 혹시나 다른 이유를 찾고싶어도 도저히 못찾겠네요 .... 

안녕하세요. 약 1년 간, flow cytometry 조건을 잡고 있는 대학원생입니다.. 주변에 조언을 구할 곳이 없어, 계속 구글링하다가 질문 드리게 되었습니다.   저는 마우스에서 primary cell을 분리한 후, flow cytometry로 분석하고 있습니다. 세포를 분리한 후에는 총 두 개의 그룹으로 나눠 staining을 진행합니다. 1. 2개의 surface staining. 2. 1개의 surface staining -> Fixation/Permeabilization -> 1개의 intracellular (nucelar) staining. Staining을 하기 전까지의 모든 과정은 동일하게 진행합니다. Fixation/permeabilization 단계에서는 'eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set' 제품을 사용하여 4℃에서 O/N 한 후, 다음날 intarcellular staining을 진행합니다.   제가 질문 드리고 싶은 부분은 surface staining만 한 후, 7aaD를 이용하여 live cell을 gating하면 약 90 ~ 95% 정도가 live cell인 반면, fix/perm 과정을 거친 후, live cell을 gating하면 50~70%만이 live cell이라는 점입니다. (Fix/perm하는 sample의 경우 live/dead Ab를 이용하여 staining합니다.) 이렇게 까지 live cell이 감소하는건 제 실험방법에 문제가 있는 것 같아서요.. 다양한 조언을 부탁드리고 싶습니다..   또한 Fix/perm을 하면 cell debris가 많아진다고 들었는데 약 1X10^6개의 cell을 염색할 경우, flow cytometry에서 모든 샘플을 다 읽혀봐도 total events 수가 1X10^6개에 가깝게 나타나는데, stainging 과정에서 저도 모르게 loss를 많이 내고 있는 것일까요..   읽어주셔서 감사합니다:)

  Tumor lysis sample에서 cytokine screening을 하려고 하는데 빠르게 결과를 얻고 싶어서 array 위탁하려고 합니다.    혹시 추천해주시는 곳 등 있을까요?

ELISA시 standard에 detection을 넣나요? Sample에만 넣는건가요?