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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > etc.
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. SDS-PAGE와 Pulse-field gel electrophoresis 관련해서 질문드립니다
안녕하십니까 과학고등학교 재학중인 고등학생입니다. SDS-PAGE와 Pulse-field gel electrophoresis 관련해서 알아보다가 이해가 힘든 부분이 몇 있어 질문 드립니다. 먼저 SDS-PAGE 진행할 때 stacking gel과 running gel의 두 가지 종류의 gel을 사용하는데 stacking gel의 역할이 loading한 sample들이 running gel에 들어가기 전 같은 출발선상에 위치하도록 하는 것이라 알고 있습니다. stacking gel 조성이 Cl-, glycine, polyacrylamide이고 pH 6.8이라고 알고 있고요. 그런데 여기서 stacking gel이 sample들을 정렬시키는 원리에 대해 알아보았습니다. stacking gel에 포함되어 있는 glycine의 등전점이 pH 6.2이고, stacking gel은 pH 6.8이므로 glycine은 약한 음전하를 띠게되고, SDS 처리를 한 sample이 그 다음으로 강한 음전하, Cl-가 가장 강한 음전하를 띠게 되잖아요? 그 과정에서 glycine과 Cl- 사이 높은 전위차가 생겨 두 이온 사이의 단백질이 비슷한 속도로 일직선으로 내려가게 되어 출발선상에 동일하게 위치하게 된다고 하던데 높은 전위차가 단백질의 속도에 어떤 영향을 준다고 이해를 하면 될까요? 그 부분이 잘 이해가 가지 않아서요. 그리고 SDS-PAGE 과정에서 Agarose 대신 Polyacrylamide를 사용하는 이유가 무엇인가요? protein sample들 크기가 DNA, RNA같은 핵산보다 작아서라고 하는 곳도 있던데 믿을 수 있는 정보라고 생각되는 곳이 없어서 헷갈리네요. 다음으로는 pulse-field gel electrophoresis인데요, 제가 알아보기론 주로 길이가 긴 DNA 전기영동에 사용하는 방법으로 교대로 전극에 전류를 흘려 전기장의 방향을 바꾸어가며 DNA가 이동하도록 하는 방법이라고 하더라고요. 근데 이렇게 진행을 하면 UV 촬영 시에 긴 길이의 DNA sample이 지그재그 형태로 보이나요? 제가 Pulse-field 전기영동을 제대로 이해한건지 잘 모르겠네요.. 결과 사진이 어떻게 나오는 건지 사진 첨부해주시면 너무 감사할 것 같습니다ㅜㅜ   학부생, 대학원생 분들이 대화하시는 곳이라 이렇게 수준 낮은 질문 드려도 될까 싶지만 도움 청할 곳이 이곳뿐인 것 같아 질문 남깁니다.  모든 질문에 대답해주시지 않아도 괜찮습니다 최대한 빠른 답변 부탁드려요
회원작성글 ._.  |  2022.01.08
Q. 단백질 정량 질문입니다.
cell에서 2X RIPA buffer를 사용하여 단백질을 추출한 다음에 Detergent compatible Bradford 시약으로 정량하였습니다.   BSA로 R^2값이 0.99이상인 standard cruve 작성했고 이걸 바탕으로 원 sample을 1/10으로 희석해서 단백질 양을 측정하였고 최종 정량 값에서 다시 x10해서 원 sample의 단백질양을 유추했습니다. (sample마다 단백질 양은 좀 차이가 있었습니다.)   그리고 동일한 농도의 vial을 만들어 주기 위해서 (만들고자 하는 농도/원 sample의 정량 농도) x (단들고자 하는 volume)으로 희석시 넣어 줄 단백질 sample양과 UPW양을 구하고 둘을 섞어서 희석된 sample을 만들었습니다.  이렇게 만들면 sample 마다 동일한 농도가 (ex. 3 mg/ml)  될테니 SDS-PAGE 시에 동일 volume을 넣어주면 sample 마다 단백질양이  동일하게 들어갈 것으로 생각했습니다.   그런데 gel을 내리고(gel 사진은 없네요..) W.B로 확인해보니(Beta-actin) sample들의 band 색이 다 제각각이였습니다. 혹시 제가 한 방식이 잘 못되었고 다른 방식으로 진행해야 할까요? 아니면 다른 문제가 있을까요? 조언 부탁드립니다.  
회원작성글 IMMB  |  2022.01.07
Q. SDS-PAGE 밴드가 왜 이렇게 나올까요?
 일단 stacking 4% resolving 12%로 내렸고 분자량별로 내려서 제일 진한 색을 가진 샘플이 단백질 분자량이 제일 높은겁니다 tris/glycine buffer[W/O]로 통안에 채워넣고 전기영동돌렸습니다 밴드 잘나오게 천천히 100V으로 내려줬습니다 근데 이상하게 색은 나오는데 확실한 밴드가 관찰이 안돼서요 이런 경우에는 어떤 경우인가요? 샘플을 55도씨에서 추출해서 열변성이 되어 구조적인 밴드가 나타나지않는경우, 샘플에 지방이 남아있는 경우 등등 알려주시면 정말 감사하겠습니다 주변에는 조언을 구할데가 없어서요..    
회원작성글 응애에요  |  2022.01.06
Q. 단백질 열변성 온도
고등학교에서 단백질의 열변성을 이용해서 시온 스티커(온도에 따라 변하는 스티커)를 만들어보려고 하는데 약 30도일때 변성이 일어나는 단백질이 있을까요?
회원작성글 hanyeseo  |  2021.12.22
Q. 희석배수질문입니다.
elisa 이제 막시작하는 초보 입니다. 오늘 96well에 코팅 하는단계 부터시작하기 위해서 1mg/ml 을 2ul/ml으로 10ml로 희석해서(pbs) 96well에 50ul씩 분주하려고 합니다. 다른분은 100배희석후 이것을 5배희석해서 한다고 배웠다네요 이방법이 더 정확하다고 함. 저는 한번에 희석하려고 하는데 이때 계산이 1000*x=2*10000 1000x=20000 x=20ul pbs 10000-20=9980ul=9ml+980ul total 10ml 이방법이 맞나요?
회원작성글 어흥이  |  2021.12.21
Q. lyophilized peptide Sample의 정전기에 의한 변성 가능성에 대하여 질문드립니다.
안녕하세요, Synthesised peptide를 cell treat하여 cell viability를 확인하는 중, Experimental reapeat에 문제가 있어 질문드립니다.   peptide sample은 company에서 synthesis 하여, lyophilized powder form으로 배송받았으며, powder를 aliquot하여 -50'C에 냉동보관합니다.   이를 실험시 dissolution 및 Treat하여 cell viability를 확인합니다만, 현재 문제가 있는 특정 peptide의 경우 실험 할 때마다 activity의 여부가 달라집니다. 들쭉날쭉한 정도의 문제가 아니라, all or none의 문제입니다.   생각해 보건대는, powder를 aliquot 할 때 시약수저와 플라스틱 vial을 이용합니다만, 정전기가 발생하곤 합니다. 이 정전기 때문에 문제가 생긴다면, vial마다 activity가 있거나 없거나.. 할 수 있지 않을까 하는 생각입니다.   정전기로 인하여 lyophilized peptide의 charge에 영향을 주거나 할 수 있을까요? 나아가 이로 인해 activity에 영향을 줄 수 있을까요?   제가 생각해볼만한 factor는 거진 다 실험해보아, 이로 인한 결과는 아니었음을 확인하였기에 답답한 차입니다만, 장고끝에 정전기에 까지 생각이 미쳐 영향을 줄 수 있을까 여기저기 검색중입니다만 나오는 건 없군요.   혹여 정전기로 인하여  lyophilized peptide의 활성이 달라진 적이 있으신 분... 답변 부탁드립니다. 아니다. 그런 일은 발생이 불가능하다. 생각하시는 분도... 답변 부탁드립니다.   감사합니다.
회원작성글 Tedi  |  2021.12.17
Q. Sandwich ELISA- same high O.D in blank well
Sandwich ELISA조건을 잡고 있는데, Blank well에서도 od 값이 차이없이 높게 나옵니다. 간단하게 실험방법을 설명드리면, TEV-FLAG synthetic peptide를 standard antigen으로 조건을 잡고 있고, Coating plate: Maxisorp (Thermo) Capture antibody: Anti-TEV (1ug/ml) Coating buffer: 10mM PBS (pH7.4) or 50mM bicarbonate buffer (pH9.6) 4C O/N Blocking buffer: BSA based buffer or SuperBlock (Thermo) or Protein-free Blocking buffer (Pierce) 2hr @ RT Sample: Synthetic peptide (100ng/ml, 100pg/ml, blank) 2hr @ RT Detection Antibody: Anti-FLAG (biotin-conjugated) (1:1000) 2hr @ RT HRP-conjugated Streptavidin (1:10,000) 30min @ RT TMB reaction 30min @ RT 물론 매 스텝마다 PBST(0.05%)로6회 washing하구요. Peptide를100ng, 100pg, 0pg 이렇게 하는데, 모두 동일하게 높게 나옵니다 (~0.7) Capture antibody나 sample 농도에 관계없이, Detection antibody의 양에 따라 OD값이 달라지는 걸 보면, non-specific binding이란건 알겠는데, 이걸 어떻게 조건을 잡아야 할지 모르겠습니다. 혹시 HRP-conjugated streptavidin 대신 HRP가 달린 2ndary antibody (IgG) 를 사용해야할까요? 조언 부탁드립니다! (추신: 혹시라도 FLAG ELISA를 측정할 수 있는 다른 방법이 있을까요? Cell media에서 측정을 해야해서 꼭 ELISA로 해야하는데, 상용화된 키트가 없어서요.)  
회원작성글 sm226  |  2021.12.15
Q. SDS-PAGE는 well 당 얼마씩이 보통이죠??
딱히 안 정해져 있다고 하는데 보통 well당 얼마 씩 하는지 궁금합니다. 저는 well당 20ug 하는데 다른 분들은 어떻게 하는지 궁금해요   또 최대 몇까지 가능한지 알고 싶습니다.   저희 실험실에서 제가 단백질 실험을 처음해서 가이드를 만들어야 해서 도와주세요....  
회원작성글 으남적  |  2021.12.10
Q. 서로 다른 종의 같은 기능의 단백질
브릭에 계신 선배님들, 안녕하세요.  유전자 및 단백질을 공부중인 대학원 생입니다.  본래 유전자(유전자 발굴, 전사체 분석)를 주로 공부했으나, 박사 졸업을 위해 단백질까지 공부하면서 시행착오를 겪고 있습니다. 선배님들께 단백질과 관련된 질문으로 글을 남깁니다.    특수 천연물(A)을 합성하는 유전자를 발굴하고 서열, 기능 등을 파악하는 연구를 진행중입니다.  특수 천연물(A)는 박테리아에서 주로 연구가 되었는데, 현재 제가 연구중인 식물종에서도 동일한 물질이 형성되는 것을 파악했습니다. (HPLC 분석)   다른 선행연구에서 박테리아가 특수 천연물 A를 합성할 때 유전자 a1, a2, a3 3개가 관여하는 것이 보고되었습니다.   제 연구종(식물종)의 mRNA 전사체 분석 결과 a1과 동일하고, a2 및 a3와 유사한(Blast 결과 효소 이름이 유사한) 유전자 서열을 발굴했습니다.   a1의 경우, blast. interpro, swissmodel, catalytic site, domain 등을 비교했을 때 박테리아와 식물체의 유전자 및 아미노산 서열이 거의 동일했습니다. 계통수를 그렸을때 그 거리도 가깝습니다.    하지만 a2의 경우, interpro, catalytic site, domain 등 그 기능이 같음을 확인할 수 있었으나,  계통수를 그렸을 때 그 거리가 멀고 같은 기능을 하는 단백질인가? 라는 의문을 갖게 되었습니다. 물론 종이 다른 만큼 계통적인 거리가 멀 수 있습니다. 하지만, 계통적인 거리가 먼 다른 이유중 하나는 domain과 catalytic site(Zn binding site, pp binding site, active site 등) conserve site의 서열은 잘 alingment 되지만, 식물체의 아미노산 서열에 추가된 서열이 있어 alignment시 gap이 생기고, 박테리아 서열보다 약 20~30% 길게 분석됩니다.  워낙 연구가 되지 않던 유전자다 보니 계통수를 작성할 때 다른 박테리아 유전자 서열, 식물체 mRNA 서열을 제외하고 reference 삼을 정보가 없습니다.  이럴 때, 동일한 기능을 하는 단백질임을 파악할 때 판단하는 어떤 기준이 있는지 알고싶습니다.    *저는 도메인, active/catalytic site가 동일하므로, 동일한 기능을 하는 단백질이 겠다.. 라고 판단하고 있습니다. 하지만, 앞으로의 실험을 위해 정확히 판단 후 추가 실험을 진행하고 싶습니다.  *선배님들 단백질 기능에 대한 판단을 여쭈어보고싶습니다.  *또, 단백질에 대한 공부가 부족하므로, 어떤 자료를 참고해 공부하면 좋을지 조언 부탁드립니다.    감사합니다.    좋은 하루 되세요.       
회원작성글 팡  |  2021.12.09
Q. 단백질을 농축한 후에 투석하는거랑 투석 후에 농축한거랑 같나요?
안녕하세요 예비 대학원생입니다. 제가 단백질 stock solution을 만들어야 하는데, 농축과 투석의 순서가 단백질 농도 등의 결과에 영향을 미치는지 궁금합니다. 원래 계획 상으로 투석을 통해 buffer change를 하고 농축을 해서 원하는 농도의 stock solution을 얻으려고 했습니다. 저희 실험실에서는 단백질 sample의 1000배 부피의 buffer로 투석을 시키기 때문에 투석->농도 의 순서대로 실험을 진행하면 buffer의 양이 너무 많아져서 고민입니다. 농축을 하고 투석(buffer change)를 하면 필요한 buffer의 양이 훨씬 줄어들것 같은데 이렇게 진행을 해도 수율이나 이런 것이 비슷할까요?   아니라면 순서에 따라 각자 가지고 있는 장단점이 있을까요? 조언해주시면 감사하겠습니다 
회원작성글 wpqkfcnldj..  |  2021.12.09
Q. self ubiquitination 질문
안녕하세요,, self ubiquitination 실험을 진행하려고 하는데  특정한 E3 ligase의 활성 유무를 확인하고자 합니다.  그런데 아시다시피 E3 ligase의 경우 종류가 80종에 다다르는데...  특정한 한개의 E3 ligase의 활성 유무를 self ubiquitination으로 확인할 수 있는 방법이 있을까요??   답변 주시면 감사드립니다.... ㅜㅡㅜ
회원작성글 휴우우  |  2021.12.08
Q. 초보 BCA 정량하는 사람입니다 ㅜㅜ 제일 기초적인 질문 입니다 ㅜㅜ
현재 BCA 정량 하는 법을 배우는 사람인데... 진짜 정말 간단한 희석배수에 대해 질문합니다.... 먼저 BCA할때 10배 단계희석을 하는데 .... 저는 200ul 기준-> buffer 196ul+sample 4ul 으로 50배. 100배. 200배..... 실행합니다. 그런대 갑자기 20배 40배 80배 로 진행하라고 하는데... 그럼  200ul 기준-> buffer 190ul+sample10ul 이것이 20배가 되는거고 10배 희석과정과 동일 하게 가야하는건지... ㅠㅠ 정말기초적인거라...   다찾아봐도 10배 희석밖에 나오지 않아 여쭤봅니다 ㅜㅜ serial dilution의 기본이 잘모르겠네요 ㅠㅠ 도움이 필요합니다 ㅜㅜ  
회원작성글 어흥이  |  2021.12.07
Q. ADH 냉동 보관 문의드립니다 ㅠㅠ 도와주세요 제발 ㅠㅠ
안녕하세요    alcohol dehydrogenase 반응실험을 하고 있습니다ㅠㅠ 효소 실험은 저희 랩에서 제가 처음이라 너무 헷갈리고 귀 동냥 해가면서 "냉동 보관시 너무 자주 얼렸다 녹혔다 하면 활성이 떨어질 수 있다"라는 사실을 들었습니다.  먼저 효소는 시그마에서 구입하여 lysphlized된 powder 형태를 물에다가 녹이고 수용액 상태로 만들었습니다. (조효소도 마찬가지로 제조하였습니다.) 그리고 하루치 쓸만큼만 E-tube에 소분하여 냉동하였습니다.  이 때 glycerol을 넣냐 마냐 고민이 되었는데 저는 바로 바로 효소를 쓸 거고, 오래동안 보관하지 않을 것 같아서 넣지 않고 냉동하였습니다. (glycerol을 넣지 않고 효소 보관을 하시는 분들도 있어서 저도 그렇게 따라하였습니다.) 그리고 사용시에는 얼음에 e-tube를 박아두고 천천히 해동하려고 합니다. 근데 문제는 잘 녹지를 않네요ㅠ 녹는데 오래걸리는데 이렇게 해도 괜찮을까요? 
회원작성글 cashbee  |  2021.12.07
Q. Lac Z 어떻게 읽나요?
안녕하세요, 혹시 Lac Z 어떻게 읽어야하나요?   
회원작성글 200610  |  2021.12.06
Q. 논문초보인 학부생입니다...protein half life assay에 대해서 아무리 찾아도 안나오는데
정확하게 뭐다 라고 써진 논문이나 글들을 찾기 힘드네요 ..  실험방법에 대해서 아시는 분 계신가요.. ㅜ
회원작성글 고주망태  |  2021.12.05
Q. 단백질 정량 실험 Bradford assay 실험 결과에 대해서 질문이 있습니다.
Bradford assay를 이용해서 단백질 양을 정량하는 실험을 하였습니다. 먼저 BSA standard를 D.W로 희석해서 5개를 만들고 미지 시료를 준비한 후에 각각 Bradford assay reagent 를 분주한 후 incubation 해주었습니다. 그러고 나서 흡광도를 측정하고 농도-흡광도 관계식인 y=0.001x+0.1955식을 얻었습니다. 저희가 구한 미지시료의 흡광도를 측정하여 농도값을 얻었는데 이를 표준용액과 비교하였을 때 농도가 125~250에 있어야하는데 실제로는 미지 시료의 농도가 250이 넘은 291.5의 값을 얻었습니다. 이러한 오차가 생긴 농도가 더 높게 나온 이유가 무엇일까요? 실험과정에서 별다른 실수는 안했는데 결과값이 이상하게 나오네요...ㅜㅜ
회원작성글 생화학22  |  2021.12.04
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