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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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Q. RT-PCR 결과때문인데요1!!!
RT-PCR을 돌리고 있는데요... 몇 번 PCR을 해도 control이랑 보고자 하는 marker가 1000배 이상이 나오는데 이렇게 결과 나오신 분 계신가요??ㅠㅠㅠ 3~4천씩 차이가 나요,,, 많이 발현되어야 하긴 하지만 다른 논문들 보면 많아봤자 5배정도 차이 나던데,,,, primer 문제일 가능성이 클까요??
회원작성글 김쫑  |  2019.11.14
Q. PCR primer sequence 찾는 법
안녕하세요, PCR를 하기 위한 gene primer를 찾고 있습니다. 보통  NCBI gene 에서 해당 gene의 ID를 찾고 이를 harvard primer bank 에서 sequence를 찾아서  primer를 짜고 주문을 하는데요,   지금 찾지 못하고 있는 것이 있어 도움을 요청합니다. YAP이라는 protein을 찾고있는데요. YAP1 이라는 gene은 NCBI gene에서 찾을 수 있는데, 저는 여기서 phosphorlayted YAP에 대한 gene ID를 찾고 싶은데 아무리 찾아봐도 방법을 잘 모르겠습니다   혹시,  특정 gene의 phosphrolayted 상태의 gene primer 의 sequence를 찾는방법이 있을까요?   도움 부탁드립니다.
회원작성글 얀욘  |  2019.10.27
Q. cho cell pcr control로 쓸수있는 프라이머가 뭐가있을까요
조셀을 타겟셀로 실험하고있는데 조셀의 파지티브 컨트롤의 프라이머가 뭐가잇늘까용
회원작성글 아저올어오렁  |  2019.10.15
Q. real-time PCR 기기를 사용할 때
mRNA의 발현량을 측정하려 하는데요   REAL-TIME PCR 결과 나오는 그래프에서 mRNA 발현량의 단위는 보통 무엇인가요?
회원작성글 ㅈㄱㅈㄱ  |  2019.10.14
Q. Real time PCR 결과 (cell line), 만배 이상 차이? (cytokine)
Cell line : Raw264.7 Target : TNF-a, IL-1b Agents : LPS + X(연구용 시료), X, LPS   TNF-a에서는 control과 50배까지... IL-1b에서는 최대 6만배까지의 차이를 보았습니다.  심지어 단독 LPS 처리군과의 차이도 만배를 넘는 group도 있습니다..   50배도 쉽게 보질 못했는데..    ct 값은 GAPDH에서 14-15 Target gene은 15-30 이고, 이상은 넘어가지 않습니다.    n=3 수행을 해도 큰 차이 없이.. 일정하게 나왔는데..    이 정도의 차이가 날수도 있는지, 선배님들의 의견을 여쭙습니다!
회원작성글 금강상품권  |  2019.09.30
Q. gene specific primer로 cDNA 합성할 때 질문이요
안녕하세요 .. gene specific primer로 cDNA 합성 후 QC 중에 질문이 있어서 문의 드려요 invitrogen 사 kit 이용해서 RT를 했는데요 Oligo dT로 RT를 하든 gene specific primer로 RT를 하던 target gene primer로 qPCR을 해보면 Ct값이 크게 차이가 안나더라구요 .. 뭔가 더 specific 하게 될 줄 알았는데 ;;  인서트지를 보면 oligodT는 50uM, gene specific Primer는 2uM 로 넣으라고 되있던데 primer 농도에서 차이가 나는 걸까요? 그리고 무엇보다 이상한 점은 Gene specific primer로  RT를 하고 beta-actin으로 PCR, qPCR을 하면 잘 뜨는 거예요 (gene specific ≠ beta actin). cDNA와 gDNA size 구분되도록 primer를 디자인했는데 beta actin cDNA 사이즈의 밴드가 빵빵하게 잘 뜨고 target gene 과 Ct값도 크게 차이가 안나요 ..   실험이 잘못된건지 뭔가 제가 모르는 루트로 가능하기도 한 일인지 궁금합니다. 선배님들의 조언 부탁드려요    
회원작성글 arimari  |  2019.09.30
Q. RNA seq 데이터 그리기 (gene therapy 후 transcriptome profile 변화 목적)
안녕하세요.. 돌다돌다 브릭까지 여쭤봅니다.    1) gene therapy 후 대조군과 실험군 모두 RNA seq 보내어 데이터를 받았습니다. 2) 원하는 그림과, scheme은 구상이 되어, 많은 양의 RNA data로부터 실제로 원하는 그림을 그리는 일이 남았는데 어떻게 시작해야될지 모르겠네요.. 3) 혹시, RNA seq data 분석을 처음 하는 저같은 사람이 도움을 받을 수 있는 website나 정보란이 있을까요?  
회원작성글 냠냠줄기세포  |  2019.09.25
Q. 나모 금속에 형광염색
철과 아연이 유기 나노화된 물질에 형광염색 할 수 있는 곳을 찾고 있습니다.
회원작성글 별빛세상  |  2019.09.09
Q. splicng이 없는 유전자는 rt pcr primer를 어떻게 짜나요?
제가 알기로 RT-PCR primer를 짤때 exon과 exon끼리 primer를 디자인하여, dna에 의한 컨탐을 줄인다고 알고있습니다. 그런데 splcing이 없는 유전자의경우는 sample에 dna가 조금이라도 있을시 rt-pcr값이 이상하게 나올것 같은데 그렇지 않나요?
회원작성글 galtab  |  2019.08.23
Q. 간단한 !! 질문입니다 !! qPCR, Primer mixture 관련 ! 많인 경험 공유 부탁드립니다. !!!
안녕하세요~ 다름이 아니라 궁굼한 사항이 있어 글 올려봅니다. 많은 관심 부탁드립니다.   qPCR 을 진행하기 전에 Primer mixture 를 제작을합니다. 보통은, cDNA를 qPCR tube에 넣고 Primer mixture를 제작하여 용량에 맞게 분주를 합니다.   여기서 질문입니다.   Primer mixture 의 조성은 아래와 같습니다. 1) Primer FW 2) Primer Rev 3) DW 4) SYBR Green ------------------ 저 같을 경우 10개 정도(이상)의 primer 를 동일한 cDNA sample로 확인 해야합니다.   sample 및 primer 수가 많다보니 시간적인면에서 너무 많이 소요가됩니다.   여기서, 궁굼한 것은 위 조성대로 전날에 미리 primer mixture를 미리 만들어 -20'C에 보관하고, 실험을 할 때 보관했던 것을 녹여서 분주해도 큰 문제가 없는지 궁굼합니다.   이런 경험 있으신분 조언 부탁드립니다.   감사합니다.
회원작성글 지나가는사람  |  2019.08.21
Q. c2c12 세포에 insulin 투입
안녕하세요! insulin을 c2c12 cell에 투입해 culture 하려는 고등학생입니다. 모르는 게 많아 구글링을 해보니 제가 아직 모르는 전문용어가 너무 많아  bric 사이트에서 눈팅만 하다가 끄적여봅니다. 우선 이 실험을 도와주시는 분께서 c2c12 cell을 사용한다고 하셨는데  1. 꼭 c2c12 cell을 사용해야할 필요성이 있나요? 일단 다른 세포에 비해 분화될 가능성이 높고 doubling time도 하루도 채 안된다고 알고 있습니다.  2. c2c12 세포의 배양 조건은 무엇인가요? 제가 아는 바로는 37도씨의 온도가 필요하다는 것 외엔 없습니다 ㅜ 3. insullin이 c2c12 cell culture에 영향을 주는 메커니즘은 무엇인가요?
회원작성글 한쏘쏘쏘  |  2019.08.07
Q. Real-time PCR 할 때 Phospho form detect에 관하여 질문드립니다.
안녕하세요. 저희 연구실 내 연구원님으로부터 한 가지 들은 이야기가 있어서 조사해보다가 도저히 이렇다 할 답안을 찾지 못하여 고수님들께 여쭙고자 합니다. 현재 Real-time PCR 기법을 사용하여 특정 primer의 mRNA expression level을 보고 있는 중인데요. 연구원님 말씀으로는 PCR을 할 때 사용하는 primer로는 Non-phospho form은 측정이 가능하나 Phospho-form이 붙은 primer는 측정이 안된다고 하셨어요. Phospho form의 양이 primer마다 차이는 있겠으나 Non-phospho form보다 존재하는 양이 매우 극소량이라 PCR로는 Detect가 어려워서라는 말씀을 해주시기는 했습니다. 인터넷과 논문 찾아가면서 왜 PCR로는 Phospho form은 Detect를 하는 것이 어려운지를 찾아보는데 이렇다 할 답변을 찾지 못해서 여기에 질문 올립니다. 고수님들의 명쾌한 답변 부탁드립니다.   긴 글 읽어주셔서 감사합니다!
회원작성글 SSacred  |  2019.08.02
Q. qRT-PCR 시 대조군이 여러개일 때 질문드립니다
지금 까지 보통 대조군 sample이 하나인 경우에 여러 실험군 sample들과 비교 하여 유전자 발현을 보았는데요 대조군 sample이 여러개인 경우에 어떻게 계산해야하는지 잘 모르겠어서요... 대조군들 간에도 발현 변화를 봐야할것같은데... 그래프도 막대그래프가 아닌 박스플랏 같은걸로 그려야하나요? 예를 들면 대조군a 대조군b  환자c 환자d 환자e 이런 경우입니다 대조군a를 기준으로 잡으면 대조군b는 어떻게 처리해야하는지 등등...  
회원작성글 adfgqw  |  2019.07.22
Q. pcr 시행시 pipetting 오차를 줄이기 위해서
안녕하세요, 요즘 pcr을 수행하고 있는 초보 연구자 입니다. 제가 SYBR kit로 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 3ul total 9ul로 맞추고 cDNA를 1ul 씩 넣어주거든요. 먼저 9ul 씩 qPCR 용 well에 넣어준 후 cDNA 1ul씩 넣어줍니다. 근데 가끔씩 튀는 값이 있어요. relative conc가 0.3,0.2, 이러다가 4이러는 경우가 있습니다. 물론 Triplicate하고요, Triplicate끼리는 거의 값 차이는 없습니다. 저는 qPCR도 triplicate하지만 sample도 triplicate 해서 실험해서(6well plate에서  3개well이 같은 조건) 토탈 qPCR에서는 9개 동일값이 나오게됩니다..근데 꼭 한 샘플, 즉 9개 중 3개가 가끔씩 농도가 이상하게 높게 나오는 경향이 있어요... 그래서 pipetting 실력이 부족한가 싶어서 좀 수정해서 다시 실험해 볼까 합니다. cDNA 희석을 해서 넣어준다고들 하던데, 그렇게 되면 다른 넣어주는 component도 다 볼륨을 해당 배수만큼 넣어주어야 하는 거죠? 다른 질문자들에 대한 답변을 읽어봐도 정확히 이해되지 않아 질문드립니다 ㅠㅠ 도와주세요 ㅠㅠ
회원작성글 쏭이쏭  |  2019.07.18
Q. in situ hybridization 이슈
Hi all Brix users!  I think it is better to type in english in terms of explaining what I am doing and what is going on with my in situ.  So I tried 3 times in total and all came out with no hybridization. I use S35 radioactive isotope to detect mRNA level on my rat brain slices.  My ultimate question is that i cannot figure out why the hybridization failed. When we look at the flim after the exposure, we could only see the whole tissue were transfered to the flim not specific to our target region of interest in the brain slices.. so big non-specific binding occured... Is there anyone who could help me on what might have gone wrong during the process?  Thank you! 
회원작성글 jiyoungsam  |  2019.06.14
Q. RNAseq (Whole transcriptome analysis) 발현 비교분석 할때,
안녕하세요? 저는 종양조직에서 RNA-seq (Whole transcriptome analysis) 공부하던 중 한가지 여쭤보고 싶어서 올립니다. [약물 반응군환자] vs [약물 비반응군환자] 군에서 FPKM 값으로 유전자 A,B 발현을 log2(FPKM+1) 값을 가지고 비교하는 중, A-B (빼기), A/B(나누기) 와 같이 [상대적값]도 어떤 [지표]로써 통계적 의미를 가지고 사용할 수 있을까요? 만약, 가능하다면, DESEQ 과 같이 normalization된 count로 비교해야만 할까요? FPKM이나 TPM의 절대값으로 비교는 의미가 있을까요? 로그변환을 거친, log2(FPKM+1) 값으로 서로 빼거나, 나눈 값도 통계적의미를 가질 수 있을까요? 감사합니다.
회원작성글 mdmgnoh  |  2019.06.12
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