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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. sds-page 이후 trnasfrer 전에
sds-page gel을 내린 후에 잠시 할일이 있어서 그런데 (1시간 정도 )    trnasfer 하기 전 transfer buffer(TG)[10xTG 100ml + 200methanol + 700DW) 에 담구고 4도씨 냉장고에  보관해도 괜찮을까요?     
회원작성글 비포어위스타  |  02.24
Q. 웨스턴 베타액틴 봐주세요
이게 오늘 한 베타액틴입니다. 정량에 문제가 있는걸까요? mouse 근육에서 cytoplasmic 추출한것이고 3반복 하였습니다. 그런데 같은 membrane에서 87kda ikk는 일정하게 나왔습니다. 43kda b-actin은 두번째, 다섯번째 군에서 일정하게 나오지 않아서 뭐가 문제일까요?? ikk에서 일정하게 나온것으로 보아서는 정량문제는 또 아닌거 같긴합니다...
회원작성글 강산이  |  02.23
Q. 클로로퀴닌 용해
Chloroquine을 DMSO에 20 mM 처리하여 용해 시켜서 사용하고 있었는데 용해가 잘 되지 않아 계속 볼텍싱하면서 쓰고있었는데, DW에 용해를 시키니 용해가 잘 되었습니다. DMSO에서 용해시킨 클로로퀴닌과 DW에서 용해시킨 클로로퀴닌으로 혹시 몰라 둘다 실험을 각각 진행하고 있는데 결과가 비슷하게 나올까요..?
회원작성글 쥬뗌므  |  02.23
Q. protein 발현
고수님들, 질문이 있어서 이렇게 올려요. 저는 ovarian cancer로 실험을 진행 중인데요. A2780 또는 HeyA8에서 이미 발현이 높은 (즉, actin만큼의 protein이 관찰이 되는 by Western blot) 단백질이 어떠한 chemo를 treat한다고 해서 그 protien이 본래의 발현보다 훨씬 더 많아 질 수 있나요,,? 그럴 수 있겠지만 확률로 보면 보통 적은 발현이 많아지거나 많은 발현이 억제되는 것은 보았는데 이미 많은 발현을 더 높인다는게 확인해본 결과, 실험이 잘 모르겠네요,,, 24시간 처리 시 농도별로 줄어들고 48시간 처리시 농도별로 늘어나기도 하는데요.. (control보다는 아님) 패턴이 가늠이 안갑니다... 혹시 이러신 적 있을 까요...?
회원작성글 나다니95  |  02.23
Q. western blot SDS-PAGE 문제점좀 잡아주세요 ㅠㅠ 첨부파일
석사 입학 예정인 초보 연구생입니다. 그림에서 보시다시피 자꾸 기울어져서 밴드가 내려옵니다.  그리고 밴드도 퍼지는데 1. 버퍼문제인지  2. gel 조성문제인지. 3. sample buffer문제인지 아니면 다른 문제점이 있는지 모르겠습니다. 
회원작성글 태태태  |  02.23
Q. SDS PAGE Gel 제작 질문드립니다.
western blot 결과를 보고 어디서 문제가 생긴건지 잘 모르겠어서 질문드립니다.                PARP(116,89)                       actin(45)                  caspase-3(35,19,17) 모든 항체는 cell signaling 제품을 사용하였고 동일한 gel에서 실험을 진행하였습니다. 액틴은 깔끔하게 잘 나오는데 1. caspase-3에서 cleaved form의 잡밴드 및 낮은 감도 2. PARP 밴드가 너무 지저분하게 나옴 (큰사이즈가 쫌 지저분하게 나오는거 같아요..) 이 부분을 어떻게 해결해야할지 모르겠습니다ㅠㅠ 위 사진같은 깔끔한 결과를 보고싶습니다..   protocol  1. separating gel (12%) 제작 후 pipette으로 분주한 뒤 70% ethanol 넣고 15분정도 굳힙니다.  이때 냉장보관하던 acacrylamide/bisacrylamide solution이 너무 차가우면 gel 제작에 영향을 많이 미칠까요? (APS, TEMED 넣기 전 RT에서 inverting 고려) 2. comb를 꼽고 stacking gel을 분주한 뒤 15분 정도 굳히고 comb제거 3. sample 및 size marker Loading (10well 10ul씩)    loading 후 보면 well은 평평하게 형성되었습니다. 4. SDS-PAGE stacking부분에서는 50V, separating 부분은 100V 이때도 cooling이 필요할까요? loading buffer가 미지근합니다. 5. 100V 1시간 Transfer (icing) PVDF membrane 사용 끝나고 gel을 확인해보면 큰 사이즈의 size marker가 꽤 남아있습니다..(~70kda정도) 시간이나 전압을 조정 할 필요가 있을까요? 6. ponceau S staining 후 DW로 washing 5분 2회(빨간색 최대한 빠지도록) 7. 5% skim milk blocking 1시간~2시간 8. 1X TBST washing 5분 4회 9. 1차 항체 overnight (보통 20시간) (5% BSA / 1:1000) 10. 1X TBST washing 5분 4회 11. 2차 항체 1시간 (5% skim milk / 1:5000)  12. 1X TBST washing 5분 4회 13. ECL solution A,B 1:1로 섞은 후 detecting
회원작성글 셀러문  |  02.23
Q. Western band가 번지듯이 나오는건 왜일까요? ㅠㅠ 또 b-actin이 일정하게 발현되지 않는 부분궁금합니다..
안녕하세요 브릭에 처음 글을 올려봅니다. 요새 Western을 열심히 반복실험하고 있는데 band가 잘 나오지 않아서요..   밴드사진입니다. 마커는 b-actin입니다. 밴드가 저렇게 물감번지듯이 나온건 처음이어서요. b-actin이 일정하지 않게 나온적은 있어도 저렇게 번지듯이 나온적은 처음입니다. ㅠ 혹시 transfer할 때 밀착이 잘 안되어서 이런걸까요? 혹시몰라서 stripping 후 다시 항체 붙여서 찍어보려고 합니다.. 이 밴드는 target marker의 밴드인데 위와같이 번지듯이 ? 끌리듯이 내려오는현상이 target marker에서만 지속되어 이 부분은 어떠한 개선이 필요할까요 ㅠㅠ ? 이 밴드는 제가 평상시 웨스턴했던 b-actin밴드입니다. 이렇게 나오는건 잘 나온걸까요? 단백질정량이 미숙해서 b-actin인데도 일정하게 나오지 않는부분은 단백질 정량을 개선해야할까요? ㅠㅠ 점점 갈수록 실험이 이상해지는듯해서 스트레스받는 요즘입니다.ㅠㅠ  1. 단백질 정량은 BSA로 STD그래프 (농도범위 25ug/ml ~ 2,000ug/ml) 그려서 정량하고있는데 R^2값이 항상 0.96~0.97정도로 나오긴합니다..ㅠ 2. gel은 10% gel을 쓰고있습니다. SDS-전기영동은 gel당 20mA조건으로 2장을 내리기 때문에 40mA에서 1시간~1시간30분정도 원하는 타겟단백질이 적당히 내려올때까지 진행중입니다. 3. loading 단백질량은 Cell에서 단백질을 많이 얻기가 힘들어 최대 25ug으로 진행하고 있습니다. (최소 5ug ~ 25ug까지 진행해보았습니다.) 4. loading은 sample의 경우 comb에 19uL씩 로딩하고있습니다. 4. Transfer는 100V에서 아이스에 박고 1시간정도 진행합니다. (1X Transfer buffer) 5. 항체 희석비율같은경우 b-actin은 1:5000, target marker는 1:500으로진행했습니다.  6. blocking 은 2.5% BSA로 냉장고에서 O/N 시키고 다음날 1차 항체 5시간정도 붙히고, Wash 10분씩 4번, 2차항체 1시간 붙히고 Wash 10분씩 4번 후이미지 찍고있습니다.   진짜 반복실험만 주구장창하다가 너무 답답해서 글을 남겨봅니다. ㅠ (질문이 많고 두서없이 내용이 긴 점 죄송합니다.) 고수님들의 조언을 듣고싶습니다..흑흑 웨스턴 초보 도와주시면 감사합니다.. ㅠㅠ   
회원작성글 yeruyeru  |  02.23
Q. ImageJ를 이용한 Protein quentification에 관하여 질문드립니다.
안녕하세요. 이제 막 학위를 시작한 파릇파릇한 대학원생입니다.   선배님들께 여쭤보고 싶은 것이 있어 글을 남기게 되었습니다.   제가 총 9개의 protein을 W/B하여 p38 밴드를 관찰한 결과 4번 Line에서 밴드가 연하게 나왔습니다. 이를 해결하기 위해 전체 밴드를 image J로 수치화 (background X)하였고 positive 단백질 수치를 기준값 "1"로 두었습니다. (positive 값 / positive 값) 나머지 밴드의 경우는 ( 밴드 값 / positive 값 )을 통해 대비값을 구했습니다. 이 때 4번 라인은 0.2 정도가 나왔습니다.   그렇다면 혹시 W/B 재실험 시 해당 4번 단백질을 5배 정도 넣어 준다면 밴드가 나머지 밴드와 동일하게 나타나는 것이 제 생각이고 이 때 실험의 data는 p38의 밴드가 동일하게 나타난다면 p-p38에 대한 실험을 진행 시 논란이 없다고 생각합니다.   혹시 이렇게 단백질의 양을 조절해도 괜찮을까요? 감사합니다.
회원작성글 대학원 도비  |  02.22
Q. sds-page, transfer band 휘어짐 원인
안녕하세용 3월 입학을 앞둔 인턴입니다.   western blot을 하고 있는데 sds-page 후 ponceau S staining에서 다음과 같은 결과를 얻었습니다. 왼쪽은 각 sample간 intensity가 동일하게 깔끔하게 잘 나오는데 오른쪽은 sample간 intensity도 다르고 marker부터 들쭉날쭉합니다.  gel이 어땠는지 기억나지 않아서 sds-page에서 생긴 문제인지 transfer과정에서 생긴 문제인지 모르겠습니다. 왼쪽, 오른쪽 모두 동일한 날에 제조한 page gel을 사용하였고 모든 실험재료, 과정이 동일합니다. 그런데 두 가지가 다르게 나오니까 정말... 원인을 모르겠습니다. 혹시 이런 현상(?)을 겪어본 분이 계시다면 조언 해주시면 감사하겠습니다. 참고로, PAGE gel은 12% separating gel, 5% stacking gel이고 110V, 약 2시간 running했습니다. Transfer는 110v, 3시간 했습니다.
회원작성글 LylLyl  |  02.21
Q. 도와주세요! secretory protein (western, concentration)
 안녕하세요!  지금 secretory protein을 western blot으로 확인하려고 합니다.   제가 키우는 세포에 이 protein을 transfection하여 stable cell로 만들었구요,   GFP로 확인하여 Transfection이 잘 된것도 확인하였습니다.     문제는, 이 protein이 western으로 절대 확인이 되지 않습니다ㅠㅠ  1. media concentration하기위해 x-spin (20 mL Centrifugal Concentrator, 10,000 MWCO ) 사용해봤는데 밴드는 전혀 나오지 않네요;   (확인하려고 하는 Protein은 35kDa 정도인데, 제가 잘못 사용했을까요?;;;)   2. Transport inhibitor를 처리하여 cell lysis를 해보아도 밴드를 확인할 수 없었고,   3. 아무리 secretory protein이여도 media 외 cell 내 아주 적은양이라도 있을수도 있어 그냥 해봐도 전혀 밴드를 볼수 없습니다ㅠㅠ 혹시 제가 정량을 잘못했는지, protein이 전혀 없는지 확인하기 위해 폰슈염색도 해보고 정말, 이것저것 다 해봤는데 a-tubulin은 잘 나오는 것을 확인하였습니다.  (harvest한 media에 ELISA를 확인해보면 나옵니다ㅠ) 어떤 방법을 써봐야할까요?ㅠㅠ 6개월을 찾지못하고 있습니다 ㅠㅠ  제발 도움의 손길이 필요합니다ㅠㅠ 
회원작성글 듈리  |  02.16
Q. (sds) native page 결과 해석 설명좀 부탁드립니다.
가운데 marker단백질은 10kD까지 표시됩니다. marker기준으로 양쪽에는 같은 sample을 로딩했습니다. 첫번째부터 dimer 7일차, monomer 0일차, dimer0일차, monomer 7일차, dimer7일차인데요, monomer와 dimer는 10kD보다 작기 때문에 marker의 맨 밑보다 더 아래쪽에 나타나야하는데 왜 그 위에 나타났는지 궁금합니다. 1. monomer와 dimer가 10k보다 높은 위치에 나타난 이유 2. gel의 맨 윗쪽에 왜 다 끌리듯이 나타나는지, (올리고머화 된 이유 제외) 3. 이럴 경우 gel의 조성을 어떻게 해야할까요? (사용된 gel은 T/G-PAG non-SDS, (4-20%) 입니다)
회원작성글 dhwl9191  |  02.16
Q. protein over expression
프로틴을 과발현 시키려면 siRNA로 처리한 후 overexpression 하도록 따로 처리를 해야하나요?  어떻게 하나요?
회원작성글 별헤는밥  |  02.15
Q. PHF20을 웨스턴하려면 어떤 cell을 이용해야하나요?
PHF20 단백질을 WesternBlotting 하려면 어떤 cell을 사용하여야 하나요? 그리고 혹시 이런 내용을 검색하는 방법이 있을까요?
회원작성글 별헤는밥  |  02.14
Q. 웨스턴 b-actin 일정하게 나오지 않습니다 ..
웨스턴 결과입니다. 베타액틴이 일정하게 나와야하는데 일정하게 나오지 않는 이유가 무엇일까요...?   
회원작성글 강산이  |  02.08
Q. Western blot과정 중 membrane을 다루는 것
웨스턴 진행할 때, blocking, wash 이후 membrane을 1st Ab 통에 넣으려다가 protein이 transfer되어 있는 부분을 핀셋으로 누른 것 같습니다... 나중에 detection할 때 밴드가 버블 생긴 것 처럼 나올까요..? protein이 transfer되어 있는 membrane은 약간의 접촉도 결과에 영향을 받나요..?
회원작성글 별헤는밥  |  02.07
Q. western transfer 후 폰슈
안녕하세요 western transfer 후 폰슈를 확인해봤는데 marker만 제대로 나오고 blot은 하나도 나오지 않았습니다. sample의 단백질 양은 690 µg/mL 였고 10,15,20 µL씩 로딩했습니다. 평소는 sample의 단백질이 1500 이상이었는데 이번에 단백질 농도가 너무 낮아서 폰슈상으로 안나온걸까요?  폰슈로 염색했을 때 blot이 하나도 안나온 적 있으신 분들은 원인이 뭐였는 지 궁금합니다.. 단백질 농도가 낮아서라면 어느정도 수준부터 안나오는건지..
회원작성글 하윤이  |  02.05
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