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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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Q. cell protein lysis buffer 조성중에 cOmplete™, Mini Protease Inhibitor Cocktail 질문이요
저희가 western blot 목적으로 cell protein lysys buffer를 만드는데 원래는 cOmplete™, Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail을 사용합니다. 그런데 주문을 잘못해서 cOmplete™, Mini Protease Inhibitor Cocktail제품을 받은 상황입니다. 이미 환불은 안되는 상황이구요   혹시 이 제품을 사용하려고 하는데 기존에 사용하던 것과 같은 효과를 얻으려면 어떻게 해야하는지 아시는 분이 계실까요...?
회원작성글 정오  |  2019.07.30
Q. Amicon Ultra-15 Centrifugal filter 재사용 방법.
안녕하십니까, 현재 사용하고있는 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters(100K)짜리를 사용하고 있습니다. 재사용법에 대해서 검색했을때, 70% ethanol에 담궈서 사용하라는 글을 봤는데 정확히 어떤식으로 wash를 해야하는지 궁금합니다. 필터 위, 아래에 다 채워야 하나요? 그리고 다시 사용할땐, DW로 헹궈주면 될까요..? 한가지 더 에탄올이나 DW를 채우고 Centrifuge를 돌려서 필터를 한번 걸러줘야 하나요? 경험이 있으신분은 부탁드리겠습니다.
회원작성글 엔지에스  |  2019.07.16
Q. mitochondrial enzyme activity 보는 방법 ㅠㅠ
다양한 compound 들의 세포에 처리하여 특정 mitochondrial enzyme (matrix안에 존재하는)  활성의 변화를 보는 실험을 계획중입니다.  cell 전체를 lysis해서 그 lysate 상태에서 compound screening을 진행 하는 것 보다는 (아무래도 protein 들의 structure가 pH나 lysis buffer에 영향을 받을 수 있을것 같아서요 ㅠ)  mitochondria를 세포에서 직접 isolation해서 보는게 어떨 까 싶은데요, 혹시 세포주에서 mitochondria 분리 후 lysis를해서 mitochondria protein들만 specific 하게 연구하시는 분들이 있는지 궁금합니다. ㅠㅠ   노하우 전수좀....   감사합니다
회원작성글 flyingkite  |  2019.07.12
Q. cell lysis하고 harvest할 때 질문입니다
protein 뽑기 위해서 sample에 lysis buffer를 뿌리고 ice 위에서 scraper로 긁어서 회수하고 있는데요, 아무래도 scraper에 소량 국물이 남는 것이 찝찝해서요 물론 그게 몇퍼센트 되지도 않으니 큰 상관은 없는 것은 알고 있지만 그냥 기분이 찝찝하네요 어쨌든 scraper에 국물을 남기지 않거나 좀더 깔끔하게 셀을 긁어낼 수 있는 방법이 없을까 하여 질문드립니다.
회원작성글 뷰냐  |  2019.07.12
Q. FtsZ 의 활성을 보기 위해 GTPase의 활성을 보려고 하는데요
제가 원하는 cell line의 균의 ftsZ를 추출해서 활성을 봐야하는 걸까요?   처음 해보는 실험이라.. 프로토콜도 같이 있다면 부탁드립니다.
회원작성글 yeseulpark..  |  2019.07.08
Q. SDS 제거 - Bradford 이용
Tissue lysis를 시켜서 bradford로 농도 측정을 하는데, 원래라면 RIPA lysis buffer 이용해서 BCA assay 하면 되는데 저희 실험실에서는 bradford 실험만 하더라구요. 그래서 원래 RIPA lysis buffer 대신해서 다른 lysis buffer를 썼는데 잘 안되는거 같아서 RIPA buffer 써보려는데 SDS가 있어서 bradford가 되지 않는 걸로 알고 있어서 혹시 lysis시키고 SDS를 제거할 수 잇는 방법이 있을가요?
회원작성글 단뷔  |  2019.07.02
Q. western blot 정량
western blot 정량 질문드립니다. cell line 별로 동일한 수로 seeding 후 정량하였는데, 세포별로 자라는 속도가 달라 bca 정량시 차이가 많이 났습니다. 몇개의 cell line이 bca standard OD 값을 넘어가는 샘플들이 있어 넘어가는 샘플은 1/2 로 dilution하여 다시 측정하고 계산하고 실험을 진행하였습니다. (dilution factor *2 곱함) 그리고 동일한 양의 단백질 양을 (ug) 로딩하였는데, 액틴간의 차이가 많이나서 질문드립니다. diluton을 샘플간에 다르게해서 이런 문제가 발생한것인지.. 이론상으로는 계산시 dilution factor를 곱해줘서 동량 로딩됬다고 생각했는데, 제가 생각을 잘못한것인지.. 고수님들 답변부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 thduddl  |  2019.06.08
Q. 단백질 농도 정량의 편차가 너무 심해요 (BCA assay, protein, Total protein, exosome)
  선배님들 안녕하세요. 저는 엑소좀을 뽑아서 약물로써 이용하고자합니다. 엑소좀의 농도를 측정하기 위해서 엑소좀에서 Total protein을 뽑고 (Trizol, RIPA buffer) BCA assay로 농도를 측정하는데요. Trizol, RIPA 추출 방법 모두 편차가 너무 심합니다.  편차가 심하다는 말의 뜻은 엑소좀에서 프로틴을 뽑을때 N=2개로 하여 뽑고난뒤 각각에서 얻어진 total protein을 N=4개로 BCA assay로 측정을 할때에 total protein의 농도는 비슷합니다. 그러나 엑소좀의 stability를 확인하고자 엑소좀을 뽑은 첫날에 날짜별로 (0/3/7/10/20/30 day) 샘플 분주를 해두고 -80도에 보관하고 날짜별로 샘플을 꺼내어 total protein을 추출하는데 첫날에 뽑았던 total protein에 비교하여 상대적으로 농도가 떨어지는 패턴을 보일것이라고 예상하였는데 (다른 논문들에서 엑소좀 추출 후 기간별로 protein 농도가 떨어지는 것으로 확인됨) 전혀 경향성이 없습니다. 그림1. Total Protein concentration (mg/mL) (Trizol) 이런 패턴인데요. ㅜㅜ   왜그런걸까요ㅜㅜ 추가적으로 RNA concentration 역시 경향이 없어요 그림 2. Total RNA concentration (ng/uL)   처음엔 Trizol로 protein을 뽑아서 시간이 많이걸리고 절차가 복잡하여 그때그때 손을 타는지 싶어서 RIPA buffer로 바꾸어보았거든요. 그런데도 여전히 경향없는 variation이 확인되었습니다 ㅜㅜ  엑소좀 농도를 protein을 기준으로 평가하시는데 다른분들은 어떻게 이 variation을 다루시는지 여쭙습니다.   짤막한 답변이라도 제겐 매우 큰 힘이 되오니 같은 경험이 있으신 선배님들 꼭 답변 부탁드리겠습니다. ㅜㅜ  감사합니다.  
회원작성글 Jay ewha  |  2019.05.26
Q. 종자에서의 단백질 추출방법
종자에서의 Virus 검정을 위해 종자에서 단백질을 추출하여 SDS page와 Western blot을 진행하고자 합니다. 일반적으로 페놀방식을 이용하여 하나의 식물체 샘플에서 단백질을 추출하며 RNA를 함께 추출하여 타겟의 유무를 이중으로 체크하고 있는데 기존의 페놀방식으로는 타겟단백질이 잘 추출되지 않더군요 혹시 western blot에 이용할 종자단백질 추출하는 좋은 방법이 있으시다면 알려주시면 감사하겠습니다...
회원작성글 WVAVW  |  2019.05.20
Q. SDS-PAGE gel을 잘라서 시퀀싱 하는방법
안녕하세요 초보연구생입니다 미생물에서 profilin을 발현시켜서 tag이 붙은 컬럼으로 정제 후 SDS PAGE를 내렸는데 타겟크기라고 생각하는 사이즈에서 밴드를 확인했습니다 이 부분으로 시퀀싱을 의뢰해서 알아보고싶은데 주변에서 듣기론 오창의 공동장비가 있는 연구원을 통해 분석해볼수있다고 하는데 혹시 해보신분이나 아시는분 계시면 알려주실수있을가요ㅜㅜ
회원작성글 아저올어오렁  |  2019.05.20
Q. atpase 억제를 보는 실험하는 학생입니다.
안녕하세요.  너무 마음이 급해서 여쭈어봅니다.  저는 어류의 알에서 atpase를 보려고하는데 제가 실험하기전 시료를 채취할때 채취후에 액체질소탱크에 넣었는데 알고보니 -20도 보관이였더라구요 ㅠㅠ ...... 또 .... ㅠㅠ 동결방지제를 생각지도 못하여서 못넣었습니다. 이렇게 되면 이 시료는 이제 더이상 쓸 수가 없는 시료일까요 ?   참고로 어류의 다른부위는 질소탱크에 보관하였다 하여서 질소탱크에서 보관하였습니다. ㅠㅠ 
회원작성글 갈잎  |  2019.05.19
Q. 같은 물질이지만 분자량이 다른물질을 혼합했을때 분자량이 평균값으로 되나요?
같은물질이지만 분자량을 달리한 샘플을 혼합했을 시 HPLC로 분자량을 측정했을 때 분자량이 평균으로 되나요? 예를 들어 A sample: 분자량 100000 Da B sample: 분자량 10000 Da 라가정하면 분자량이 평균으로 50000 Da가 되나요? 아니면 각자 다른분자량을 띄고있기때문에 HPLC peak가 2개가 뜨는건가요?
회원작성글 twseung  |  2019.05.15
Q. Rat Liver로 W.B할 때 ..!
Rat Liver로  w.b을 하는데 Liver에서 protein 어떻게 뽑으시나요..? Liver 크기가 너무 커서 저의 경우 냉동되어 있는 샘플 꺼내서 아주 조금 잘라서 protein 뽑아서 w.b하는데..이렇게 해도 괜찮은가요..? Liver 크기가 너무 커서 다 갈아서 뽑기는 힘들어서 조금씩 떼서 그때그때 쓰고 있는데 이렇게 해도 괜찮은지..w.b으로 보고싶은 Ab를 확인하고 있는데 생각보다 컨트롤이랑 차이가 안보여서..이렇게 하는게 맞는지 궁금해요. Liver가 여러 엽이 있다보니 위치에 따라 제가 보고자하는 Ab가 나오거나 안나올 수 있는지... 다른 랩에서 Liver는 사용을 안해서 여기에 물어보네요..  
회원작성글 왕초보연구원  |  2019.05.10
Q. brain tissue extraction
Western Blot을 진행하려고 brain tissue extraction 을 하는데 tissue 0.01g에 Intron 사의 PRO-PREP Extraction Solution 800ul 을 넣고 homogenize 한 뒤 13000rpm 에서 10분간 두번 centrifuge 했는데 상측액이 작은거품입자들이 뭉친것처럼 하얗게 뜨고 그 아래엔 맑은 액체가 분리되어 있습니다. 이거 지방인가요? 이걸 걷어내고 상층액을 분리해서 정량해야하는건가요?   
회원작성글 SM18  |  2019.05.07
Q. 콜라겐 타입1과 3의 함량을 정량하려고 합니다
ECM 내 콜라겐 타입 1과 3의 함량을 정량하기 위해 우선 elisa kit을 구매하긴 했는데 Sample preparation이 문제네요... Pepsin으로 녹여서 진행하자니 pH에 의한 영향으로 Elisa값이 튈 것 같고 lysis buffer 혹은 단순 pbs에서 분쇄 후 진행하자니 침전물이 많을까봐 걱정입니다. 혹시 여러분들은 어떠한 방법으로 진행하고 계신가요?
회원작성글 섬마을한씨  |  2019.04.15
Q. Cell fractionation 방법 질문입니다
실험실 초보입니다 혼자 실험을 해야하는 상황이라 막막합니다 구글링을 해도 방법이 다양해서 초짜인 제가 구분하기 너무 어려워 브릭에 도움을 청해봅니다 실험은 cell에서 특정 단백질을 보려고 핵, 미토콘드리아, cytosol로 나누어 제가 찾고자 하는 단백질이 어디에 많은지 알아보려는 것입니다 Cell fraction을 해서 western을 해야 하는데 cell fraction 할때 RIPA buffer를 어느 과정에 써야하는지 다른 buffer는 뭘 써야 할까요 그리고 sonicator? 라는 것도 사용해야 할까요? Cell fractionation에 대해 공부할 수 있는 책이나 사이트 있다면 추천 부탁드립니다
회원작성글 hy  |  2019.04.14
Q. 단백질 변성
proteinase K 넣고 50도에서 incubation 하면 색이 탁한 갈색..? 이나오다가 ice에 넣었을 때는 다시 붉은색으로 돌아오던데 왜 그런가요?
회원작성글 랩린이  |  2019.04.08
Q. Ripa buffer에서 cell lysis 후 상층액과 하층액의 성분이 궁금합니다
현재 시판되는 Ripa buffer로 cell을 lysis하고 원심분리하여 상층액만 분리해냈는데 정확한 상층액과 하층액의 구성성분이 궁금합니다 상층액에는 protein만 들어있는건지 DNA 혹은 RNA는 없는지 그리고 하층액에는 cell debris라고만 나오는데 정확히 어떤 것인지 궁금합니다(제가 찾아본 바로는 세포막 구성성분과 insoluble protein이라고 알고 있는데 맞는지 잘 모르겠습니다)
회원작성글 BCH꿈나무  |  2019.04.08
Q. Fluorometric 방법 측정시 background 값
안녕하세요. kit를 구매해서 Fluorometric 방법으로 관찰하는 중입니다. sample과 sample background를 함께 측정해서 sample-sample background=농도값 위식에서 얻어진 농도값으로 계산을 하는데. sample <sample background 현상이 벌어집니다. 그래서 background에 넣을 샘플을 60도에서 20분간 incubate하였는데도 저 현상이 그대로 유지되네요.... 혹시 sample background가 sample값보다 더 높은 현상을 해결할 수 있는 방법이 있을까요?  
회원작성글 bobaekse  |  2019.04.01
Q. bradford 단백질정량 색깔이 이상해요 첨부파일
마우스 족부조직과 지방조직을 정량했는데요 왼쪽 두개가 족부 오른쪽 두개가 지방입니다 근데 색이 처음엔 정상적으로 파란색으로 나오지만 시간이 변하면 연두색 혹은 초록색 혹은 청록색으로 변해서 사진에 보이는 것처럼 됩니다...... 뭐가 문제일까요ㅠ
회원작성글 hanah4378  |  2019.03.05
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