[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
이엔셀
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioLab 장재봉 교수
전체보기 안전점검 LABox
 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
카테고리 전체보기펼치기
질문/투표/프로토콜 등록
Q. Cloning insert sequence에 의해서 plasmid prep 수율이 변할 수 있나요??
 추워지는 날씨에도 연구하시느라 고생이 많으십니다.  제가 최근에 parvovirus의 유전자를 cloning하고 있습니다.  Elpis사의 TOPO cloning kit를 사용하고 있는데요 (pLPS vector) & promega pGEM-T-easy vector 둘다 시도 하고 있습니다.  cloning 하고 transformation한 후에  colony PCR (primer는 insert 유전자 증폭한 것과 동일한 primer를 사용했습니다.) 하여 screening한 후에 picking하여 plasmid prep을 하면 이상하게 수율이 너무 안나오네요...  동시에 진행한 다른 plasmid sample은 수율이 잘나오는데 말이죠.. pellet의 크기가 작지도 않았습니다.. vector에 cloning한 유전자에 의해서 plasmid의 수율이 달라질수가 있나요??..  긴 글 읽어주셔서 감사합니다. 도움 주시면 감사하겠습니다
회원작성글 Anchovy  |  2022.10.26
Q. dsDNA ssDNA
1 OD 흡광도에서 dsDNA 농도가 50, ssDNA가 38이라는 것은 이론적으로 아는데 ssDNA가 dsDNA의 농도의 두 배가 되지 않는 이유가 무엇인가요?
회원작성글 동글앙땡  |  2022.10.26
Q. Bacteria gene knockout 실험 관련 질문드립니다.
  안녕하세요? 저는 실험을 배우고 있는 학부연구생입니다. 박테리아 유전자 KO 실험을 진행하려고 하는데 이런 종류의 실험이 아예 처음이라 조언을 얻고자 질문을 올리게 되었습니다.  E.coli strain의 gene 하나를 KO하려고 하는데요.  저희 실험실이 단백질 관련 연구실이라 원래 유전체 편집 실험을 아예 하지 않아 굉장히 생소하고 가능할까 생각이 듭니다. 질문은,,  homologous recombination 실험을 통해서 원하는 유전자 하나만 깔끔하게 KO 시키는 것이 가능한지 궁금합니다.  그리고 이외에 또 추천하시는 다른 실험 방법이 있는지도 궁금합니다. 
회원작성글 호끄니  |  2022.10.25
Q. PCR primer GC content 질문
안녕하세요, pcr primer를 처음 짜 보는 학부생입니다. primer 앞뒤에 enzyme site와 cutting에 필요한 여분의 nucleotide를 붙이려고 하는데, primer의 GC content를 계산할 때 이 enzyme site와 여분의 nucleotide까지 포함해서 계산하나요? 아니면 Tm을 계산할 때처럼 template과 annealing하는 부분에서만 GC content를 따지면 되는 건가요...? 
회원작성글 헤리븐  |  2022.10.23
Q. real time PCR관련 질문있습니다.ㅜ 첨부파일
qPCR을 처음해보아서 논문에 명시된 프라이머와 사이클셋팅값을 동일하게 진행하였는데, 결과가 이상하게 나와서 질문올립니다.. 논문에는, PCR amplification conditions on the Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System: 58'C for 5 minutes; 95'C for 2 minutes; 40 cycles of 95'C for 15 seconds and 60'C for 60 seconds. 이라고 적혀있어, 첨부드린 사진과 같이 셋팅하여 돌렸습니다. Hold[step1: 58'c 5min, step2: 95'c 2min] PCR[40 cycle[step1: 95'c 15sec, step2: 60'c 1min]] 다음 Melt curve 셋팅은 논문에 나와있지 않은것 같아 랩실 디폴트값 그대로 돌렸습니다.  논문에 적힌 셋팅값을 제가 제대로 이해못하고 돌린 것인지, ,샘플이 5개이고 보려는 유전자가 5개였는데 각 샘플에 2개 막대픽만 나와서 혼란스럽습니다.. 랩실 디폴트값과 다르게 셋팅한 건 Hold condition부분 뿐인데 그냥 논문 무시하고 디폴트값으로 돌리는게 맞는건지,,,ㅜㅜ 논문에서 말하는 셋팅값의 정확한 의미도 알고싶습니다..자세한 condition이 나와있지않아 이해하기 힘들어요ㅠ pcr고수분들 답변부탁드려요
회원작성글 12312  |  2022.10.23
Q. PCR Smear 현상
전에는 잘되던 PCR이 갑자기 smear(끌림) 현상이 발생하게 되었습니다. 9월29일 사진 10월14일 사진                 target size 1687bp PCR조건) 95°C 3분, 95°C 30초, 60°C 30초, 68°C 1분30초, 68°C 5분 Tm) F : 68.x / R : 67.x DNA template 농도 : 모름 PCR product Total volume(20µl) : premix 10µl + F 1µl + R 1µl + template 4µl + SDW 4µl Agarose 1.2%, Ladder 1kb, Etbr 지금까지 바꿔본 조건) DNA 문제 확인 -> universal primer 사용(pcr product 조건 동일) -> 이건 잘됨 Primer 재주문 -> 실패 Template 양 바꾸기 -> 실패 Template 농도 10배, 100배 희석 -> 실패   이렇게 했는데 또 어떤 조건을 바꿔야 하는지 잘 모르겠네요. 조언 부탁드립니다.    
회원작성글 도솔이89  |  2022.10.22
Q. Cloning 과정 질문
Cloning 과정질문입니다. 1. transformation heat shock 할 때 Heat block 42도 에서만 해야하나요? Water bath는 물들어가서 오염위험 힛쇽에는 쓰지말래요. 2.heat shock후 ice 2분두고 LB 1ml넣어 37c waterbath에 1시간 두래요. Shaking incubater에 두면 컴셀 약해서 깨질위험있데요. 3.plate에 ecoli 도말할때 알콜램프에 소독한 삼각밀대 쓰면 셀 컨탐, 약한 셀 깨진다고 비드로만 굴려서 하래요. 4.DH5a 에 플라스미드 넣고 파이펫믹스하지말고 그냥 플라스미드 흘려넣으래요. 약한 컴셀 깨진다고. 1ul dna를 컴셀 100ul속에 흘려넣으면 잘 섞이긴 할까요?파이펫 믹스는 안되나요? 5.플레이트에 콜로니 뜨면 키워서 DNA프랩후 엔자임 잘라서 insert있는지 확인하잖아요.엔자임 비싸다고 ecoli 상태에서 바로 gel run해서 사이즈 맞는것만 프랩하래요 Ecoli상태에서 젤런하면 Insert가 있는지 확인 가능할까요? 이 방법 사용해보셨는지요? 답답해서 미칠지경입니다. 답변 부탁드립니다. 감사합니다. Android용 Outlook 다운로드
회원작성글 BBlue  |  2022.10.21
Q. gene level에서 특정 유전자의 overexpression 과 knock-out 된 세포주의 effect 비교를 위해 어떤 control을 사용해야 하나요?
gene level에서 특정 유전자의 overexpression 과 knock-out 된 세포주의 effect 를 비교 분석하고자 합니다.  이를 위해 비교로 사용 할 control 이 중요할 텐데요... gene level에서 특이 유전자를 overexpression 또는 knock-out을 시킨다면,  비교하기 위해 DNA 에다가 처리를 한 control이 있어야만 비교가 되는것인가요?  아니면 DNA에 아무런 처리없이 원 세포주를 control 로 삼아도 정당한 비교가 될까요?   도움을 주시면 너무 감사하겠습니다 ㅠㅠ
회원작성글 alucion  |  2022.10.20
Q. pcr에 dNTP적게 넣은경우
PCR에 2.5mM dNTP 2ul 넣게 되어있는데 실수로 2mM dNTP 2ul 를 썼네요. PCR에 영향을 많이 미칠까요? 중단하고 다시 mixture만들어서 하는게 나을까요?
회원작성글 BBlue  |  2022.10.20
Q. RNaseA
DNA prep 중입니다. Plasmid prep kit 구매시 S1 버퍼에 RNaseA 가 따로 오면 모두 S1에 넣고 사용하는데요. 어떤 시약업체는 출고때 RNaseA를 S1버퍼에 넣어 보내오던데요. RNase를 실험할때마다 100ug/ml 로 필요한 양만큼만 S1 버퍼에넣어서 쓰는게 옳은건지, 버퍼에 모두 넣는게 맞는지요?
회원작성글 BBlue  |  2022.10.19
Q. Real time PCR 결과에서 편차가 왜 크게 날까요
PCR 효율을 확인하기 위해 DNA sample을 1~10^-4까지 희석해서 5 points로 준비하고(각각 3 반복) Standard Curve type PCR을 진행하고  STD를 보면 R^@ 값도 0.999거나 1이고 효율은 90~110 사이로 나옵니다. melt curve도 단일 peak으로 sharp하게 나왔구요 3반복한 동일 sample끼리도 오차가 거의 없는 것을 확인하였습니다. primer는 GAPDH랑 cytokine용이 있는데 모두 위와 같이 나왔습니다.   그런데 cytokine 유전자 발현량을 비교하기 위해서 Housekeeping gene은 GAPDH로 하고 발현량을 비교할 cytokine이랑 같이 comparative ddCt type PCR을 진행하면, 항상 오차 값이 크게 나옵니다. 25씩 나올 때도 있을 정도로... real time pcr에서 오차가 크게 나오는게 피펫팅 때문인게  가장 크다고 알고 있는데요 mixture 준비하는 방법, 비율, 실험 과정 등등 모두 동일한데 왜 STD는 문제 없이 잘 나오는데 ddCt 비교할 때만 오차가 저렇게 나올까요
회원작성글 Crucial  |  2022.10.19
Q. DNA ligation 및 transformation 과정 관련해서 궁금한 점이 있습니다.
안녕하세요 이제 막 실험수업 듣는 학부생입니다!   transformation 이후 Amp+plate에 배양하여 다음날 colony가 뜨는지 확인하러 갔는데 하나도 없었습니다. 물론 저는 transformation과정에서 생긴 문제라고 인지는 하고 있어요. (ex. CaCl2를 pellet에 녹일 때 pipetting을 너무 쎄게 했다던가, 스프레딩을 쎄게 했던가 등등..)   그런데 transformation을 하기 전에 insertDNA와 plasmid DNA를 ligation을 했는데 혹시나 이 과정도 transformation을 하는데 영향을 줄 수 있는지 궁금해서 질문 드립니다.   1:1 1:3 insert(약280bp) 약26ng/ul     vector(약4200bp) 약30ng/ul 2ul 2ul SDW     T4 DNA ligase 1ul 1ul 10X ligation buffer 2ul 2ul Total 20ul 20ul 실험할 당시 ligation 관련 protocol입니다. total volume과 10x ligation buffer, T4 DNA ligase의 volume은 고정해 두었고, vector는 농도 50ng/ul을 맞춰주기 위해 2ul로 진행하였습니다. (인서트와 벡터의 분자량과 농도는 대략적인 수치로만 나타냈습니다) 조교님은 인서트와 벡터의 ng의 비율만큼 넣는 방법을 알려주셨는데, 인서트와 벡터의 볼륨비로 해도 상관은 없기 때문에 볼륨비로 진행한다고 하셨고, 저희는 그대로 insertDNA를 각각 2ul, 6ul만큼 넣어주었습니다.   여기서 궁금한 점은..  10X ligation buffer의 볼륨을 2ul로 고정하는 이유가 무엇인가요? 1) 벡터와 인서트의 ng비로 1:1을 맞추면 인서트는 0.15ul정도만 넣어도 되는데 2) 벡터와 인서트의 볼륨비로 1:1을 맞추면 인서트는 2ul을 넣어야 하잖아요? 물론 ligation 반응하는데 있어서 인서트가 많을수록 반응은 잘 일어나겠지만 1번과 2번의 볼륨 차이는 약 13배나 차이가 난다는 건데, 반응하는 물질의 양에 따라서 buffer나 salt농도는 다르게 해줘야 하지 않나요? 볼륨비로 하던, ng비로 하던 1:1을 하던, 1:3으로 맞추던 간에 10X ligation buffer의 양은 달라야 한다고 생각하거든요. 따라서 ligation할 때 buffer 등의 salt농도를 제대로 맞춰주지 못해서 생긴 문제로 transformation할 때에도 영향이 어느정도 있을거라고 생각하는데..   물론 조교님이 알려주신 프로토콜에 문제가 있을거라고는 생각은 안하지만 제가 전공지식이 너무 부족하고 실험도 처음이라 이해가 안가는 부분이 너무 많네요 ㅠㅠ 도와주세요..
회원작성글 형준팍  |  2022.10.19
Q. Gel extraction 수율 문제
안녕하세요   cloning을 진행중인 학생입니다.   제한효소 처리를 통해서 자르면 아래 처럼 선명하게 잘리고 양도 굉장히 많은데, gel extraction만 하면 수율이 굉장히 낮아집니다. 제가 사용하는 gel extraction kit 방법은 GM buffer를 넣고 50도에서 10분간 녹여준 다음 column에 넣고 13000rpm 1분 centri 이후 wash buffer 넣고 13000rpm 1분 centri 후 빈 column 한 번 더 13000rpm 1분 centri 하여 완전히 말려주기 빈 column에 elution buffer를 넣고 조금 기다렸다가 13000rpm 1분 centri 하는 것 입니다.   프로토콜 상에는 문제가 없는 것 같은데 혹 짐작 가는 원인이 있으신지 여쭙고 싶습니다.
회원작성글 수박고구마  |  2022.10.18
Q. sequencing이 잘 되지 않는 이유를 알고 싶습니다.
안녕하세요, 현재 석사진행중인 학생입니다..   현재 target gene의 primer를 design하여 PCR후 전기영동한 결과 원하는 size의 target band가 one band로 확인되었습니다.   기타 dimer나 밴드끌림현상도 없었고, purification, Big-dye PCR, sequencing까지 진행했는데, 중간부분부터 mixed한 양상이 보이더라구요.   같은 sample을 농도만 바꿔 여러번 진행했는데, mixed한 결과를 보이는 well에서는 Forward, Reverse 모두 보이고, 또 깔끔하게 보이는 샘플은 Forward, Reverse 모두 깔끔한 결과로 나왔습니다.   염기서열도 원하는 gene으로 확인 되었구요..   sample이 문제라면 전부 동일한 양상으로 mixed한 결과가, 또 primer의 문제라면 한방향에서는 잘 나와야 하지 않나 싶어서 여쭈어봅니다.   고견 부탁드립니다..
회원작성글 jleep  |  2022.10.17
Q. plasmid transformation confirm 방법
integration된 균주는 colony pcr을 통해 integration의 유무를 확인할수있는데 plasmid를 transformation 진행한 colony는 잘 되었는지 확인을 할수있는 방법이 있을까요?
회원작성글 학헉학도생  |  2022.10.17
Q. cloning 시 primer frame
안녕하세요. cloning을 위하여 primer를 제작하는 와중에 궁금증이 생겨 질문드립니다. vector는 pET-32a를 사용할 예정이고, 제한효소는 EcoRq과 Hind III를 이용할 예정입니다. vector map은 저렇고, 제가 cloning할 부분은 CDS 부분이 아니여서 primer 제작 시 제한효소 sequence와 start codon을 넣고 하려고 하는데, 이 때 frame 맞추는 거에 대한 질문이 있습니다. 단백질 발현을 위해 frame을 맞춰야 하는데, 염기서열을 보면 3개씩 아미노산으로 translation이 되니 primer 제작 시 이것도 함께 맞춰야 하는거죠? 예를 들어, cag aat tcc ~이런식으로 되어 있을 때, primer 프로그램을 돌리면 5'-3'로 갈 때, ag aat tcc로 되는데, 괜찮은건가요? EcoR1 GAATTC+ start codon ATG + ag aat tcc 이런식으로 제작하는 게 맞는건지 primer 주문 전에 여쭤봅니다.  미리 감사합니다^^
회원작성글 꼭  |  2022.10.17
Q. DNA 산화스트레스 반응에 대해 궁금한 것이 있어요
dna 손상이 되면서 dna가 분해되나요? 그럼 dna 덩어리에 과산화수소를 반응시키면 덩어리가 풀리게 되나요? 과산화수소랑 dna가 반응하면 부산물로 기체가 발생하나요??
회원작성글 Wkdnduk  |  2022.10.16
Q. qPCR Multiplex하고 싶은데 dye를 FAM, TAMRA, Cy5 이렇게 사용해도 될까요?
1번 probe FAM-BAQ1 2번 probe TAMRA-BHQ2 3번 probe Cy5-BHQ2 이렇게 짰는데 보통 5’FAM-3’TAMRA 이렇게 짜더라구요.. 근데 제가 짠것처럼 5말단에 각각 FAM, TAMRA이렇게 달아서 해도 될까요?? 그리고 dye에 따라 sensitivity가 다른가요??
회원작성글 soor  |  2022.10.15
Q. plasmid DNA, gDNA sequencing
가끔 어떨때는 cloning한 colony를 mini prep 후 sequencing을 보낼때가 있고, gDNA를 sequencing을 보낼때가 있던데 이 둘의 차이를 알수있을까요?
회원작성글 학헉학도생  |  2022.10.12
Q. low copy plasmid prep
아래 질문을 하고 low copy일 수도 있다고 했는데,  Plasmid를 midi prep (preparation)을 하게 되면 일반 vector의 경우 400-600 ug/mL 농도가 나와서  Cell Transfection 할 때에 잘 사용하고 있어요.  그런데 사이즈가 큰 lentiviral vector (0.8~12kb)가 들어간 E.coli에서 plasmid를 prep 할 때에,  Elution 용액을 70도로 데워서 elution을 해도 30~100 ug/mL 농도가 나와요. 가~~~~끔 농도가 높게 나오기도 하는데, 이게 case by case 같이 유독 그 vector가 농도가 들쭉날쭉해서,  혹시 lentiviral vector plasmid prep 할 떄에 주의사항이나, 방법적으로 알고 있어야 하는 것이 있는지 궁금합니다.  판매사에서는 high copy라고 하지만, 해당 브랜드에서 구매한 것이  대다수 뽑힐 때에 문제가 있는 것으로 보아,  copy수가 높지 않다고 가정하고,  혹시 plasmid가 low copy일 때는 plasmid prep 과정에서  high copy보다 키우는 양을 대략 몇 배 준비해야 할까요?   보통 midi prep 에서는 전날 50 mL media 에 seed culture 해서  37 도에서 over night으로 키웠어요. 양을 4~5배 늘리면 될까요?   
회원작성글 clickclick  |  2022.10.11
이전  01 02 03 04 05 06 07 08 09 10  다음
실험 회원 등급이란?
실험Q&A 회원등급안내
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크 광고